北大學者發表JBC封面文章：真核細胞DNA復制起始新機制

　　來自北京大學生科院的研究人員發表了題為“Sap1 is a replication-initiation factor essential for the assembly of pre-replicative complex in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe”的文章，發現了一個新的DNA復制起始蛋白，這將極大推進人們對真核細胞DNA復制起始機制的理解。

　　這一研究成果公布在Journal of Biological Chemistry雜志封面上，文章的通訊作者為孔道春，金長文，汪濤三位老師。

　　DNA復制的研究已經歷了三個主要階段：第一階段是20世紀50年代到70年代末，主要是研究原核細胞DNA復制叉里的生化反應，包括復制蛋白/酶的確定及它們生化作用的闡明；第二階段是60年代末到80年代末，主要是確定真核細胞DNA復制叉里蛋白/酶及闡明它們的生化作用； 第三階段是研究真核細胞DNA復制起始機理，這個階段從上個世紀80年代末開始，一直到現在。為什么真核細胞DNA復制起始的研究有一個專門的階段呢？主要原因是真核細胞DNA復制起始過程非常復雜、且高度調控，以保證我們基因組的穩定性。

　　真核細胞DNA復制起始研究的一個標志性的突破點，是經過多年的尋找終于在1992年找到了識別DNA復制源的蛋白---ORC (Origin Recognition Complex)。這個工作是美國冷泉港Bruce Stillman實驗室完成的。90年代中期，確定了真核細胞DNA復制起始的一個核心步驟是pre-RC (pre-replicative complex)的形成， pre-RC形成于細胞周期的G1期；同時也確定了ORC，Cdc6和MCM是pre-RC的組成成分。Cdc6是Leland Hartwell在1973年命名的，確定Cdc6的生物功能與DNA復制相關是后來許多實驗室的工作。MCM（Mini-chromosome maintenance）復合體的亞基是1984年Bik Tye通過遺傳篩選首先確定的，她的文章里也提到了MCM應該與DNA復制相關。直到90年代后期才證明MCM是DNA復制解旋酶，這個證明過程來自于許多實驗室的工作， 但業內還是認為MCM是Bik Tye發現的。2000年，Paul Nurse 和Marcel Mechali實驗室同時證明Cdt1也是pre-RC的成分， 但Cdt1是David Beach在1994年首先發現的。在David Beach的文章里，有一個實驗數據指出缺失Cdt1基因的裂殖酵母孢子，發芽后不能進入細胞的S期，猜測Cdt1的功能可能與DNA復制相關，但他并沒有證明Cdt1是DNA復制蛋白。細胞不能進入S期，可以有很多原因。 從1973年到2016年的43年時間里，總共確定了四個蛋白/酶是pre-RC的組分，即ORC，Cdc6/Cdc18, Cdt1, 和 MCM；其中，ORC被認為是Bruce Stillman 實驗室發現，MCM被認為是Bik Tye實驗室發現。這四個蛋白在出芽酵母到人細胞，是非常保守的。DNA復制起始機制的研究，主要是發現pre-RC的成分及它的裝配機制。

　　在真核細胞DNA復制起始領域，有三個主要問題幾十年里一直沒有解決。 它們是：1.從裂殖酵母到人細胞，pre-RC的裝配機制沒有闡明；2.從裂殖酵母到人細胞，DNA復制源的結構沒有闡明；3.人細胞DNA復制源的位置、即DNA復制起始位點，一直沒有在基因組范圍內確定。第一個問題關系到對DNA復制起始機制的理解， 第二和第三個問題關系到理解高等真核細胞是如何選擇DNA復制起始位點的及如何能保證染色體DNA上的每一個片段在一個細胞周期內能被復制一次。

　　圖1 DNA復制起始蛋白Sap1功能總結

　　最近，孔道春教授研究組發現了一個新的DNA復制起始蛋白，它是pre-RC的一個必需組分，在裂殖酵母里叫Sap1蛋白。它在多細胞生物里的同源蛋白也已經被孔道春教授實驗室找到。他們發現Sap1是一個DNA復制源結合蛋白，證明Sap1和ORC結合在DNA復制源上不同的位置，但Sap1和ORC在復制源上相互作用。研究組進一步證明Sap1是募集Cdc18（裂殖酵母里Cdc6的同源蛋白）到DNA復制源上的必需蛋白。孔道春教授和北京大學金長文教授及南方科技大學汪濤副教授合作取得一系列進展：Sap1結合DNA的功能域的晶體結構得到闡明（汪濤老師實驗室的工作）；Sap1與DNA相互作用的生化機制通過核磁共振的方法得到闡明（金長文老師實驗室的工作）。Sap1及其在高等真核生物同源蛋白的發現，也闡明了裂殖酵母到人細胞的DNA復制源的結構。與出芽酵母不同，裂殖酵母和多細胞生物的DNA復制源結構由兩個必需DNA序列決定，一個序列被ORC結合，另一個被Sap1結合。人細胞DNA復制源的全基因組位點，也已經被孔道春教授實驗室精確確定，文章待發表。