Sean M. McCarthy and Martin Gilar
Waters Corporation, Milford, MA, U.S.
引言
寡核苷酸合成是非常高效和高產率的過程。在固相載體上進行寡核苷酸反應的典型產率為每耦合階98～99.5%。在典型的多階寡核苷酸合成中，雜質聚集在一起，即使是一般大小的21基體寡核苷酸的總產率也達到67～90%，較長鏈的寡核苷酸的產率相應較低。研究人員通常需要使用純度高于初步合成混合物的材料。因此，用于基因敲除、基因分型和診斷目的寡核苷酸通常需要在合成后進行純化。適合實驗室規模寡核苷酸純化的經濟可行的解決方案很少，而現有的方法（比如離子交換色譜分析法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法）通常比較繁瑣和費時。在本應用說明書中，我們介紹了一種成本低、速度快的中等數量材料的純化方法，單次進樣載量高達140 nmoles，采用沃特世 ACQUITY UPLC?系統和寡核苷酸分離技術（OST）色譜柱化學技術可達到95%以上的最終純度。所提出的純化規模與標準的寡核苷酸合成規模匹配良好（50至250 nmol）。下述方法可在15至30分鐘時間內完成寡核苷酸純化，得到高純度產品。
結果和討論
樣本
RNA寡核苷酸5' -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3'由供應商處購買，并在110 μL的0.1 M 醋酸三乙胺（TEAA)中進行復溶，得到大約2.8nmol/ μL的溶液。為防止降解，樣品是在使用前不久制備的。
HPLC條件
RNA寡核苷酸通過沃特世Alliance? HPLC生物分離系統進行純化，使用了沃特世 XBridge? BEH OST C18 4.6 x 50mm的2.5 μm色譜柱，采用離子對反相色譜法進行分離。1
液相色譜系統：沃特世 Alliance HPLC生物分離系統
色譜柱： XBridge OST BEH C18 4.6 x 50mm, 2.5 μm
柱溫： 60 ?C
流速： 1.0mL/min
流動相A： 0.1M TEAA，pH 7.5
流動相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN
梯度： 30 – 52.5% B洗脫10.0分鐘(0.15% ACN／分鐘）
檢測： PDA，260nm
分離產物用沃特世 PDA檢測器在260nm處檢測。流動相A由0.1% M醋酸三乙胺（TEAA）組成，流動相B為80:200.1 MTEAA/乙腈。柱溫保持在 60℃。
如圖1中所示，盡管寡核苷酸合成的效率很高，在21-基體中仍存在許多失敗序列。
盡管色譜柱上超負荷加載了更大的質量負荷，分離度仍保持N-1, N-2... 雜質在主峰前洗脫。對21-基體寡核苷酸主峰從頂點開始進行適當的切割，就會得到極高純度的產物。