華大基因再出手單細胞轉錄組學測序技術的系統分析

　　單細胞轉錄組測序(Single-cell RNA-seq)是在單細胞水平對轉錄組（mRNA）進行測序的一項新技術，可發現細胞群體中真正起作用的細胞，特別適合對高度異質性的干細胞、腫瘤細胞及胚胎發育早期的細胞群體進行研究，認識細胞分子機制和基因調控網絡。單細胞RNA-seq技術需要在測序前制備文庫。

　　2019年4月9日，華大基因的研究團隊在Genome Biology上發表了題為“Comparativeanalysis of sequencing technologies for single-cell transcriptomics”的研究論文。該論文提供了標準化的scRNA-seq資源，其可用于新的scRNA-seq文庫制備方案和測序平臺進行基準測試。

　　于此同時，2019年4月2號，深圳華大基因研究院在Genome Research上在線發表了題為Efficient and unique co-barcoding of second-generation sequencing reads from long DNA molecules enabling cost effective and accurate sequencing, haplotyping, and de novo assembly的文章。在這里研究人員開發了stLFR技術，這是一種利用經濟的第二代測序技術從長DNA分子中獲得序列數據的技術。stLFR代表了一種易于自動化的解決方案，可實現高質量的測序，定相，SV檢測，支架，經濟高效的二倍體從頭基因組裝配以及其他長DNA測序應用。

　　單細胞RNA-seq（scRNA-seq）已成為解剖細胞異質性，解開細胞狀態以及識別不同細胞類型的亞群結構的既定方法。使用合成RNA加標法對不同的scRNA-seq方法和技術進行了基準測試。然而，迄今為止，大多數scRNA-seq方法需要cDNA文庫與短讀取Illumina測序平臺兼容。

　　最廣泛使用的Illumina平臺使用聚合酶方法逐步測序。通過片段或單細胞cDNA的片段化制備文庫，然后添加定制銜接子。模板被淹沒在圖案化的流動池中，以與固定的引物結合并洗滌以除去未結合的末端。結合但自由的模板末端進一步與附近的引物相互作用，形成橋結構。使用相同的引物通過PCR合成第二鏈，然后洗滌并重新形成橋。這種橋式擴增通常在流動池的緊密物理簇內產生超過一百萬份的模板拷貝。這里，將引物DNA聚合酶和修飾的核苷酸的混合物添加到流動池上的富集模板中。在每個循環期間，每個簇內的片段包含互補的單個修飾的核苷酸和堿基特異性可切割的熒光團，而未結合的片段被洗掉。使用全內反射熒光（TIRF）顯微鏡對流動池進行成像，以鑒定摻入的，然后裂解修飾的堿。重復進行核苷酸添加、延伸和切割的循環，以確定DNA序列。

mESC scRNA-seq實驗和測序的示意圖

　　在這里，研究人員提出第一份報告，將更廉價的BGISEQ-500平臺與用于scRNA-seq的Illumina HiSeq平臺進行比較。研究人員生成了468個單細胞和1297個匹配的單個cDNA樣本的資源，在具有RNA加標的兩個細胞系上執行SMARTer和Smart-seq2方案。研究人員使用單端和雙端讀取在兩個平臺上對這些庫進行測序。這些平臺在基因表達的量化和低技術可變性方面具有相當的靈敏度和準確度。

mESC和K562 scRNA-seq實驗示意圖

　　研究人員的數據集和比較性能評估為其他學者提供了一個巨大的標準化資源，以進一步調查潛在的技術偏差，包括GC含量、同種型定量、不同單鏈核糖核酸序列協議的閱讀長度的影響、技術和測序平臺。匹配的1297個單細胞數據集和注釋將作為科學界新協議和計算方法的基準和比較的理想起點。