實驗概要
本文以沙門氏菌為例介紹了協同凝集試驗(Coagglutination test)的原理及操作流程。
實驗原理
金黃色葡萄球菌細胞壁上的A蛋白(SPA)，具有和大多數哺乳動物IgG的Fc片段發生非特異性結合的特性，而IgG的Fab片段暴露在菌體的表面，仍保持抗體的活性，當與特異性抗原相遇時，IgG的Fab片段便與抗原結合起來，從而由抗原把已標記有IgG的SPA菌相互連接，而引起協同凝集反應。其特點是既保持了標記抗體的特異性，又提高了抗體的敏感性。含A蛋白的金黃色葡萄球菌在反應中起到載體和“放大器”的作用。
主要試劑
種類很多，較簡單的一種為葡萄糖肉湯或瓊脂，配方如下：
蛋白胨10 g
Na2HPO4?12H2O 2 g
葡萄糖1 g
氯化鈉3 g
牛肉水1 000 ml
調pH值至7.8，即為葡萄糖肉湯培養基。如在其培基中加入瓊脂25 g，即為固體營養瓊脂。
實驗材料
菌種：目前國際上公認的含SPA豐富的菌株叫CowanⅠ，菌種編號為ATCC12598或NCTC8530；我國衛生部藥品生物制品檢定所將該菌株編號為26111。
由我國篩選確定含SPA豐富的菌株有1800株、25株、799株、HH3株等。
國際上公認不含SPA的菌株是Wood46，衛生部藥品生物制品檢定所將該菌株編號為26107。以上菌種均可由衛生部藥品生物制品檢定所提供。
實驗步驟
1. SPA菌穩定液的制備
1) 取CowanI或Wood46菌種，接種在肉湯培養基內經37℃培養18～24h，再轉種有營養瓊脂的克氏培養瓶中，每瓶3～5ml，搖勻，使菌液布滿整個培養基表面，放37℃溫箱培養18～20h。
2) 每瓶以10～20ml無菌生理鹽水洗下菌苔，以3 000 r/min離心15min，棄去上清液，再用無菌生理鹽水將沉淀懸浮后離心，如此再洗滌兩次菌體，然后用含0.5%福爾馬林的0.01mol/L pH值7.4的磷酸鹽緩沖鹽水制成10%的菌懸液(V/V)，室溫放置3h或過液。
3) 將上述菌懸液放56℃水浴加熱30min，迅速冷卻，再用磷酸鹽緩沖鹽水洗離3次，最后用含疊氮鈉(NaN3)為0.01%～0.05%的磷酸鹽緩沖鹽水制成10%(V/V)的菌懸液。4℃冰箱保存。
2. SPA菌診斷液的制備即將上述穩定液與已知的抗血清結合。
1) 取10%SPA菌穩定液1ml，離心棄上清，再用磷酸鹽緩沖鹽水洗菌體一次，并加緩沖鹽水至1ml，懸浮菌體，然后加沙門氏菌AFO多價血清0.1ml，(注：血清預先放56℃水浴加熱30min，進行滅活處理)。SPA菌和血清充分搖勻，放37℃水浴中作用30min，此間應不斷振搖，以保持菌體呈懸浮狀態，以利于菌體與IgG結合。
2) 將與抗體結合后的SPA菌液以3 000 r/min的轉速離心15min，棄上清，并用磷酸鹽緩沖鹽水懸浮菌體洗離2次，以洗去未給合的剩余血清，最終加含0.05%～0.1%NaN3的緩沖鹽水10ml。這種菌懸液即為1%標記的SPA菌診斷液。
在制備穩定液、診斷液的過程中，應同時作不含A蛋白的葡萄球菌及含A蛋白葡萄球菌與正常血清感作的對照。
3. 操作方法試驗時，取診斷試劑一滴和待檢或已知菌苔或抗原置于玻片上，用白金環或玻棒混勻，在數分鐘內即可觀察結果。一旦發生凝集，葡萄球菌凝集成清晰可見的顆粒。
注意事項
1. 制備好的SPA菌穩定液，于4℃冰箱中至少可保存8個月，并不影響其與抗體結合的性能。
2. 免疫血清的效價及特異性是本反應中的一個關鍵因素。只有具備良好的免疫血清，才能制備出敏感性高、特異性強的SPA菌診斷液。
3. 所用洗液及稀釋液的pH值，是影響反應敏感性的重要因素。試驗前要進行優選確定。在沙門氏菌的檢測中，以應用pH值6.0 PBS效果較好。
4. 對被檢標本進行煮沸處理，是消除非特異性反應的一種有效方法。
5. 反應特異性的證實，可用SPA菌特異性花結試驗對凝集陽性反應物進行證實。具體方法是：釣取陽性凝集物，涂布于玻片上，進行革蘭氏染色。鏡檢時，如見有革蘭氏陽性的葡萄球菌和被檢菌團聚在一起，則為真陽性反應，否則為假陽性反應。