單克隆抗體技術：細胞融合

實驗概要

本文介紹了單克隆抗體技術——細胞融合實驗的操作流程。

實驗原理

細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如仙臺病毒，此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。
聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1 000時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩定，與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4 000者，常用濃度為50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO₃調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50％濃度，pH偏堿時融合效應最高。也有采用30%～50％濃度的PEG加上10％二甲亞砜。不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。
融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。

主要試劑

1. 1640培養液100ml
2. 完全1640液100ml
3. 2.5％FCS－1640液50ml
4. HAT培養液100ml
5. 50％PEG：取分子量4 000，高純度的（日本進口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO₃調整。

主要設備

1. 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶
2. 40孔塑料培養盤

實驗材料

供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。

實驗步驟

1. 準備好脾細胞。
2. 在50ml沉淀管中混合10⁸脾細胞和10⁷小鼠骨髓瘤細胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
3. 室溫400g離心3min，使細胞沉淀。
4. 移去上清液。
5. 輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達融合溫度。
6. 加預熱至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現，滴加過程要求持續2min。
7. 加1ml1640液，邊加邊搖動，持續1min。
8. 重復7一次。
9. 加1ml 1640液，邊加邊搖動，持續0.5min。
10. 重復9一次。
11. 加1640液15ml。
12. 室溫，400g離心1min，使細胞沉淀。
13. 去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
14. 往已于前一日種有飼養細胞的40孔塑料培養盤中滴加融合的細胞液，每孔1滴（約0.05ml）。
15. 輕搖后，放入5％CO₂飽和濕度的37℃溫箱中培育。
16. 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細胞吸出，根據需要加入適量的飼養細胞。
17. 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現，但也有在1個月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后，吸取上清液，檢查抗體。
18. 對繼續生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同時保存于液氮和進行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產生抗體細胞的變異和丟失。

注意事項

1. 技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。
2. 融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操作技術。