單克隆抗體的純化——蛋白A瓊脂糖純化

目前常用的純化方法有：鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等方法達到純化目的，也有采用較簡便的酸沉淀法。最有效的純化法為親合純化法，常用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交聯，制備親合層析柱將抗體結合后洗脫，回收率可超過90％。

腹水（單克隆抗體）

蛋白 A-瓊脂糖 CL-4BTr1s 緩沖液 pH 8.6檸檬酸鹽緩沖液 pH 5.5乙酸鹽緩沖液 PH 4.3甘氨酸?Cl 緩沖液 pH 2.3中和緩沖液 pH 7.7

2.5 cm 玻璃層析柱紫外流通檢測儀紫外分光光度計和石英比色杯超濾器及 ×M50 超濾膜

1)將蛋白 A-瓊脂糖置于 50 倍體積的 Tris 緩沖液中充分溶脹。在室溫下將其灌入直徑為 2.5 cm 玻璃層析柱中，用 Tris 緩沖液平衡。

10-20 mL 腹水中的抗體，可用干重大約為 3 g 的蛋白 A-瓊脂糖純化。

2)腹水液稀釋于 3 倍體積的 Tris 緩沖液，以 1-5 mL/min 的速度上樣于蛋白 A-瓊脂糖柱，用 Tris 緩沖液洗柱子直至所有的未結合的蛋白質都被洗脫，采用 A280 監測流出液。

3)依次用 2-3 倍柱床體積的檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液以及甘氨酸?Cl 緩沖液連續洗脫結合蛋白質，洗脫液直接接入裝有中和緩沖液的管中。中和緩沖液的體積應為所收集液體積的 1/4。

4)采用 ELISA 法檢測洗脫液的抗原特異性 MAb。

5)在超濾器中濃縮所分離的單克隆抗體到 1-5 mg/mL，所用超濾膜為 ×M50。將單克 隆抗體儲存于-20℃。測定 A280。以計算抗體濃度，鼠的 IgG 溶液 1 mg/mL=1. 44 吸光度單位。

另一種緩沖液系統（由 Amersham Pharmac1a B1otech 建議的）對于某些單克隆抗體具有更高的結合能力。這些備擇的緩沖液如下所示:

甘氨酸-OH 緩沖液（替換 Tris 緩沖液）

0.04 mol/L 檸檬酸鈉/0.02 mol/L 氯化鈉 pH 6.0 及 pH 5.0 (替換檸檬酸鹽緩沖液）

0.04 mol/L 檸檬酸鈉/0.02 mol/L 氯化鈉 pH 4.0 (替換乙酸鹽緩沖液）

0.04 mol/L 檸檬酸鈉/0.02 mol/L 氯化鈉 pH 3.2 (替換甘氨酸?Cl 緩沖液）

來源：《精編分子生物學實驗指南》第五版