單克隆抗體的細胞融合(cellfusion)過程

融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。
 
融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。
 
1．試劑與材料
 
(1) 供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。
 
(2) 1640培養液100ml。
 
(3) 完全1640液100ml。
 
(4) 2.5％FCS－1640液50ml。
 
(5) HAT培養液100ml。
 
(6) 50％PEG：取分子量4 000，高純度的（日本進口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調整。
 
(7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
 
(8) 40孔塑料培養盤。
 
2．操作方法
 
⑴ 準備好脾細胞。
 
⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
 
⑶ 室溫400g離心3min，使細胞沉淀。
 
⑷ 移去上清液。
 
⑸ 輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達融合溫度。
 
⑹ 加預熱至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現，滴加過程要求持續2min。
 
⑺ 加1ml1640液，邊加邊搖動，持續1min。
 
⑻重復⑺一次。
 
⑼ 加1ml 1640液，邊加邊搖動，持續0.5min。
 
⑽ 重復⑼一次。
 
⑾ 加1640液15ml。
 
⑿ 室溫，400g離心1min，使細胞沉淀。
 
⒀去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
 
⒁ 往已于前一日種有飼養細胞的40孔塑料培養盤中滴加融合的細胞液，每孔1滴（約0.05ml）。
 
⒂ 輕搖后，放入5％CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
 
⒃ 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細胞吸出，根據需要加入適量的飼養細胞。
 
⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現，但也有在1個月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后，吸取上清液，檢查抗體。

 
⒅ 對繼續生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同時保存于液氮和進行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產生抗體細胞的變異和丟失。