單克隆酶免疫色度分析篩選方法
AOAC 方法：986.35，987.11，993.0均為單克隆酶免疫色度分析篩選方法。現以 AOAC 公定方法 AOAC993.08《SalmonelIa-Tek）》為例做一介紹。
該方法陽性的檢測結果應是客觀的，必須用配有450nm 濾光片的光度計來進行測試。只有當陰性和陽性對照均有可接受的光密度讀數時，陽性結果才是有效的。
（1）原理
沙門氏菌抗原的檢測是基于用特異性單克隆抗體進行的酶免疫分析（EIA）用抗沙門氏菌抗原的單克隆抗體包被于聚苯乙烯微量小孔的內表面，將樣品和對照加入中。樣品中如有沙門氏菌抗原存在，則將被吸附在孔上的特異性抗體吸收。沖洗小孔后，加入接合劑與被抗體吸收的沙門氏菌抗原結合。再沖洗小孔，除去未結合的接合劑，然后再加入酶底物。當用終止液終止反應時，出現的藍色則轉變為黃色。樣品中是否有沙門氏菌抗原取決于該顏色產生的光密度。
（2）儀器
①微量條板架 能放置1～8個微量條板的聚苯乙烯框架。
②條板密封紙 覆蓋微量板的粘合紙。
③內嵌式包裝物 （用于固定放置試劑）。
④培養箱 能于35.0℃±0.1℃～37.0℃±0.1℃恒溫。
⑤水浴箱
a.能于42.0℃±0.5℃和35.0℃±1.0℃恒溫。
b.能于100.0℃±0.1℃恒溫。（注意:也可用100℃的高壓滅菌器或流動蒸汽發生器代替。）
⑥手動或自動 EIA 沖洗系統 系統設計為沖洗12×8微量板的被包被的小孔。包括用于吸小孔內容物的真空泵和用于將沖洗液注入各小孔的分裝系統。
⑦EIA 板讀數器 具有450nm 濾光片的光度計，能讀出微量板的數據。
⑧微量移液器 能精確地移放50～20μL 液體的單管或多管的移液器。一次性的微量吸嘴。
⑨貯液槽 多管移液器用的試劑儲存槽用于容納分裝到微量板孔內的 EIA 試劑。
⑩取孔穴的工具，沒有包被的小孔黑環標記。
（3）試劑
①包被抗體的微量條板 聚苯乙烯微量條板，每個條板包含用沙門氏菌的單克隆抗體包被的12個孔。于2～8℃貯存。
②對照抗原
a.陽性對照 加熱滅活凍干的圣地亞哥沙門氏菌（可與沙門氏菌抗體反應）。
b.陰性對照 凍干的1％脫脂奶粉（不與沙門氏菌抗體反應）。
兩種對照均以0.1mg/mL 硫酸艮他霉素作為防腐劑。
③接合劑與接合劑稀釋液 與過氧化物酶接合的沙門氏菌抗體用含有蛋白質穩定劑和抗生素的pH7.6的 Tris 緩沖液稀釋，2～8℃儲存可保持穩定12個月。
④TMB 過氧化物酶底物（溶液 A） 含有0.4g/L 3，3'5，5'-四甲聯苯胺的專用的有機試劑。
⑤TMB 過氧化物酶底物（溶液 B） 含有0.02％過氧化氫的枸櫞酸緩沖液。
⑥25倍濃縮的沖洗液 19.25％HC1，1.25％吐溫-20、0.525％KH2PO4 和1.825％的K2HPO4 水溶液。
⑦終止液1mol/L 硫酸（當心:避免與皮膚接觸，一旦接觸，用水徹底沖洗接觸部位）。
⑧MN 肉湯（加有10ug/mL 新生霉素的 M 肉湯） 5.0g 酵母浸膏，12.5g 胰蛋白胨2.0g D-甘露糖，5.0g 枸櫞酸鈉，5.0g NaCl，5.0g KH2PO4，0.14g MnCl2，0.8g MgSO4，0.04g FeSO4 和0.75g 吐溫-80混懸各成分于1LH2O 中，加熱至煮沸1～2min，分裝于16mm×125mm 帶螺旋帽的試管中，每管9mL。旋松試管帽，于121℃ 高壓滅菌15min。制備新生霉素貯備液（100ug/mL水溶液）并過濾除菌。以無菌操作，于每一滅菌的 MN 肉湯管中加1.0mL 新生霉素溶液。新生霉素貯備液可貯存于-70℃，但解凍后，不可再次冷凍。
⑨診斷試劑（用于鑒定 EIA 檢測陽性的培養物）。（注:常規方法所需試劑）
（4）通則
一次檢驗必須用同一批號試劑盒內的物料。不要使用超過有效期的物料。為防止條板冷凝，打開前將箔包放于室溫（20～25℃）。微量板上的小孔是可以移動的取出需要量的小孔，在分離需要的小孔時僅可接觸小孔的邊緣，并將其穩固地置于條板上。
將未使用的小孔和條板放回含有硅膠劑的箔包內，將自封扣關閉。2～8℃ 儲存可達2個月。試劑在使用后置2～8℃ 保存。
免疫分析無需在無菌條件下進行。
開始試驗前，將各組分和測試樣品放于室溫（20～25℃）。每一樣品及試劑均使用單獨的吸嘴以避免交叉污染。如果用塑料槽分裝接合劑和酶底物，務必始終將它們分開使用。當不用時，將所有的組分貯存于2～8℃。
不要重復使用微量孔。
（5）樣品制備
①前增菌 在非抑制性肉湯中進行前增菌，促使沙門氏菌開始生長。所用方法隨樣品而異，應按 AOAC 967.26A（常規方法）或現行版的細菌學分析手冊進行。但下列樣品除外。
a.生的或嚴重污染的樣品 以無菌操作稱取25g 樣品放入滅菌的打碎杯內，加入225mL 滅菌的乳糖肉湯，高速（約20000r/min）打碎2min，蓋嚴杯蓋并于室溫下靜置60min。搖勻，用試紙測定 pH 值，如必要時用滅菌的1mol/LNaOH 或 HCl 調節 pH 值為6.8±0.2。在測定最終 pH 值前，蓋嚴杯蓋并混勻。以無菌操作，將每杯中的內容物移入滅菌的帶螺旋蓋的500mL 廣口瓶中。旋松瓶蓋1/4圈，于35℃ 培養24h±2h。
b.經加工的食品樣品 將前增菌肉湯于35℃培養18～24h。
②選擇性增菌 分別轉種1mL 經前增菌的培養液于亞硒酸鹽肉湯，需將亞硒酸鹽肉湯預熱至42℃，并于42.0℃±0.5℃水浴中培養6～8h；生的或嚴重污染食品的選擇性增菌必須培養18～24h。
③后增菌 從培養箱中取出選擇性肉湯，用手或渦旋混合器混勻。從四硫磺酸鹽管中移取1.0mL轉種于預熱在42.0℃±0.5℃水浴中的 MN 肉湯的管中。從亞硒酸鹽胱氨酸肉湯管中移取1.0mL 轉種于另一支預熱的 N 肉湯管中。除生的或嚴重污染的樣品外，所有食品均應于42.0℃±0.5℃水浴中培養 MN 肉湯14～18h，并于42.0℃±0.5℃（四硫磺酸鹽肉湯）或35℃（亞硒酸鹽胱氨酸肉湯）將選擇性增菌肉湯繼續培養14～18h。對于生的或嚴重污染的樣品，以它們各自的培養溫度，將選擇性增菌肉湯繼續培養6h。
④用于 EIA 分析的樣品制備——從培養箱中取出 MN 肉湯管，用手或渦旋混合器將其混勻。從每一 MN 肉湯管中移取0.5mL混合于一清潔的帶螺旋帽的試管中，在沸水浴或在流動蒸汽中加熱20min。于2～8℃ 貯存③剩余的 MN、四硫磺酸鹽和亞硒酸鹽胱氨酸肉湯管，以便對任何陽性樣品培養物進行確證。EIA 分析前，將加熱的 MN 肉湯冷卻至25～37℃。
（6）酶免疫檢測 開始分析前，應準備好下列試劑。
①1倍沖洗液的制備 稀釋20mL 25倍沖洗濃縮液于480mLH2O中。
②對照抗原 加2mL 無菌 H2O 于陰性對照瓶中，加1mL 無菌 H2O 于陽性對照瓶中混勻。加水復原的抗原在2～8℃貯存可穩定60天。
從箔袋中取出所需數量的小孔（每個食品樣品1個孔和3個對照孔）。將小孔固定在條板托中。移取0.1mL經加熱處理過的 MN 肉湯樣品放入單獨的孔中。移取0.1mL 陰性對照液，放入2個小孔中；移取0.1mL 陽性對照液，放入1個小孔中。
用條板密封紙將板封上，于37℃培養30min。
培養后，從每個孔中吸出內容物并加0.2～0.3mL 1倍沖洗液于每一小孔中，重復此步驟2次。吸出最后的沖洗液。如果用自動沖洗器而平板沒有填滿，用沒有包被的小孔填充空位。
吸移0.1mL 酶接合劑于每一孔中，封板，于37℃培養30min。
吸出并用0.2～0.3mL 1倍沖洗液沖洗每孔6次，吸出最后的沖洗液前，在玻璃試管中等量混合 TMB 溶液 A 和 TMB 溶液 B。吸移0.1mL TMB 酶底物于每一小孔中，于室溫（20～25℃）培養30min 加0.1mL 終止液于每一小孔中。按（7）在10～15min 內讀條板。（7）讀數在讀數器上選用450nm 波長。以空氣做零點（無條板托盤和條板）讀取每一孔中溶液的吸收值 A，計算陰性對照孔 A 的平均值（應為＜0.30），陽性對照的 A 必須為0.70。對照的 A 必須在此范圍內，檢測則有效。用陰性對照 A 的平均值加0.25計算臨界值。若樣品 A 大于或等于臨界值則推定為陽性，若樣品 A 小于臨界值則推定為陰性。（8）EIA 陽性樣品的確認 EIA 讀數陽性則表明可能存有沙門氏菌。由于抗體可與少數其他細菌交叉反應，故應按傳統檢驗方法從四硫磺酸鹽肉湯，亞硒酸鹽胱氨酸肉湯和混合的MN 肉湯管中蘸取培養物在 Hektoen 腸道（HE），木糖賴氨酸去氧膽酸（XLD）和亞硫酸鉍（BS）瓊脂平板上劃線分離進行養物的確證。典型或可疑菌落必須按傳統培養方法進行生化和血清學鑒定。