1. 引言
起源于我國古老釀酒工藝在可發酵中草藥產品加工中的實際應用，傳統上稱為“炮制”，現代生藥學概念就是酶解輔助提取。這在民間民族醫藥學中積累了豐富的經驗，它對中草醫藥學用于疾病的預防和治療起到了良好的作用。典型的中藥品種如紅曲,六神曲，半夏曲等，它們都是經過微生物的自然發酵加工而成。2010年版的《中國藥典》收載的含發酵類中藥的中成藥制劑有百余種之多，加上部頒標準和各地方標準收載的種類則更多。
在我國現有的中藥資源統計有12807種中，藥用植物占有11146種，資源型占比近九成。過去40多年來，伴隨著植物化學的研究進展，特別是集中在對植物多酚（plant polyphenols），又稱植物單寧，或稱鞣質的天然產物化學研究表明，以單寧為主體的植物多酚對微生物具有廣譜抗性，對絲狀真菌，酵母，細菌及病毒均都呈現抑制效應。它們的生物活性成分主要功能包括止血，抗氧化，抗病毒，促進氮代謝，改善腎功能，以及精神疾病治療，故稱謂植物多酚為天然有機化合物的新家族。
顯然，隨著中藥現代化的發展，研究可發酵中藥炮制加工過程中，除了物理化學手段外，探索應用微生物學及生物化學手段同植物多酚這類天然產物的相互作用，可能導致基于生物轉化反應的對植物多酚多樣性化學結構修飾作用，從而可能建立起微生物酶法加工的現代中藥生物制造工藝。
植物單寧通常分為可水解單寧（hydrolyzable tannins）和縮合單寧（condensed tannins）。真菌單寧酶（tannase，EC 3.1.1.20）作為一類酰基水解酶較易同前者觸發酶促反應，其用途廣泛。日本在單寧酶的R&D方面一直領先，已經在茶業飲料加工中已經取得了較好的經濟效益；國內僅有零星研究，尚存在不小差距。本文重點介紹本實驗室于90年代初，經由國家自然科學基金資助開始，定向篩選絲狀真菌單寧酶對我國獨特生物資源五倍子及滇橄欖果可水解單寧的生物轉化應用基礎實驗研究，以及生物制造的應用研究進展。
2. 微生物單寧酶酶法轉化的原理及方法
2.1 單寧酶產生菌的分離及誘變選育
目前,分離選育高單寧酶活性的微生物主要來自絲狀真菌曲霉屬（Aspergillus）的菌種。植物單寧雖然對微生物通常具有抑制生長的能力，但是作為一類植物源性可再生天然產物物質，其生物學特性決定了也具有一定的可生物降解性能。這就為從天然源分離篩選具有單寧酶活性的野生型菌株提供了可能，結合常規的理化誘變技術選育出高活性單寧酶菌株是可行的，加上利用五倍子高含量可水解單寧（65%），滇橄欖（Phyllanthus emblica，又名余甘子）果也富含45-55%（水提取物干基樣品，皮粉法測定）植物單寧物質，借助其與菌株的馴化誘導培養，結合優化的生物催化劑生長培養方法，完成生物酶法轉化單寧底物生成GA產物是可行的生物制造技術。
作者實驗室長期以來持續不斷分離選育符合食品工業加工過程要求安全規范（GRAS）的黑曲霉（Aspergillus niger）CIBCAS系列菌株；同時也借助富集培養技術分離了具有單寧酶活性（塔拉單寧）的青霉菌（penicillium sp.）野生型菌株，為誘變選育高單寧酶活性菌株奠定基礎。除了完成前述倍單寧酶法轉化制GA外，還對滇橄欖果汁借助固體培養黑曲霉單寧酶酶曲制劑進行酶法加工處理，較好地解決了攀枝花市宇森酒業公司滇橄欖果汁（酒）“去沉淀”難題。
2.2酶法水解倍單寧制沒食子酸
已經知道，植物可水解單寧物質在水相介質體系存在酸堿加熱或生物催化劑——單寧酶適度保溫條件下易水解為酚酸，糖或多元醇酸。典型例證如真菌單寧酶（EC 3.1.1.20）可在溫和生理水相介質條件下直接酶法水解五倍子單寧酸（分子量近2000）底物的縮酚酸鍵，酯鍵，積累起具有高度商業開發價值的優勢小分子產物沒食子酸（gallic acid，GA; C7H6O5-H2O=188.14），生物轉化反應介質中GA濃度達到40-60g/L。已經完成從實驗室的克量制備到500L發酵罐規模的GA公斤級試制生產。這一階段性生物酶法加工倍單寧生產GA的成果，有希望替代我國傳統林產化工酸堿水解工藝生產GA固有的高耗能，資源利用率低，以及環境保護困難的傳統舊工藝，建立起生物制造綠色新工藝。
在此基礎上，繼續完善此工業生物技術存在著2種可供選擇的方法，其一是直接利用活性菌絲的發酵法；其二則是借助選育高活性絲狀真菌胞外分泌型單寧酶產生菌生產酶制劑，制成固定化生物催化劑進行高效酶法生產。
2.2 黑曲霉單寧酶在中藥發酵產品采用“酶解輔助提取”工藝的可行性
如前所述，在篩選出高產酶（酶活/酶量）微生物菌種基礎上，借助傳統的工業微生物發酵工藝技術，對富含植物單寧的中草藥品種進行酶法加工處理，可以達到定向富集有效藥用組份，去除無用或有害雜質部分，這對提高中藥質量具有重要意義。所以，這在現代工業用酶品種占比75%都是水解酶類的今天，科學合理整合“酶解輔助提取”工藝，發展現代中藥顯然是可行的。下面以黑曲霉單寧酶用于提高余甘子鮮果酶法加工提高成品中GA含量的可行性進行論證。
2.3．1 余甘子鮮果酶法加工的植物化學基礎
經測定余甘子（滇橄欖）果實中含有的單寧成份達45-55%；植物化學研究表明主要為柯子酸，柯黎勒酸，鞣云實素，原柯子酸，柯子裂酸，GA，鞣花酸等。其中的低分子量可水解單寧（<1000）組份稱為Embilicanin-A和Embilicanin-B，以及伴同組份Pedunculagin和Punigluconin組份一起，構成了余甘子果借助單寧酶酶法加工，提升GA含量的可作用酶解底物生成GA的基本生物化學原料。同時，這些組份也成為了當今開發余甘子作為美白護膚化妝品有效部位規范提取物的關鍵化學組分。
2.3.2生物反應器選擇
基于上述的理論分析，可以合理設想：借助固體培養制酶曲，應用此生物催化劑在合適的生物反應器中同余甘子鮮果一起保溫，適度通氣攪拌，適時取樣分析（借助TLC和HPLC靈敏可靠的分析手段），監測反應過程，標繪出GA濃度的時程曲線，適時終止反應過程，收獲余甘子果進行后加工處理的工藝過程。
當然，這一酶法加工過程的工藝技術須得經過酶解過程的反應參數優化，在獲得穩定可重現性結果的基礎上，經由制備規模的逐級放大實驗研究，進行技術-經濟性評估，最后建立起技術成熟度較高的提高余甘子果GA含量的酶法加工生物制造技術體系。本質上，它就是單寧酶酶法轉化余甘子果中的可水解單寧底物生成GA的生化過程。
3. 結語
黑曲霉單寧酶作為生物催化劑實現對植物多酚，特別是對可水解單寧類的代表性物質——五倍子單寧酸的酶法水解生產GA技術途徑的成功建立，以及實現對滇橄欖果汁的酶法澄清應用研究，都為中藥的可發酵產品發展“酶解輔助提取”提供了可參考的范例。
通過從天然源借助定向富集培養技術分離選育出具有單寧酶活性的野生型菌株，結合傳統有效的理性化誘變選育技術，可較易于達到工業微生物酶法轉化實用化的程度，且為后續的絲狀真菌單寧酶分子細胞改造奠定基礎。
可以預期，以單寧酶實現對中藥可發酵產品的酶法加工過程，必將對提高現代中藥產品質量，即富集提高有用藥效學組份，降低無用或有害雜質含量具有重要意義。
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