單寧酶是一種誘導酶,可由微生物在單寧酸存在的條件下誘導產生的,對單寧酶發酵生產研究的重點多集中在曲霉和青霉上,常通過誘變育種選育和改良生產菌株以及通過優化發酵條件等途徑來提高發酵產酶活力。如Libuchi等以Asp oryzae為出發菌株,以單寧酶為誘導物,探討了菌株產單寧酶的最適培養條件。Aoki K等以酵母屬的Candida spK-Ⅰ為出發菌株,以單寧為誘導物,探討了培養的最適條件,發現添加了3%的單寧所得的單寧酶積累量最多。Bradoo S等對產單寧酶的日本曲霉進行搖瓶發酵培養條件優化,將酶活力提高了13%。龔加順等 [1] 利用離子注入技術誘導得到一株單寧酶高產的9701菌株,其搖瓶培養的酶活力高達13.0l IU/ml,比出發菌株9401的酶活力高了2.89倍,且產酶性能穩定,重復性好;對另一株單寧酶高產菌株進行產酶條件優化后,獲得了53.58mo1/s的高產酶活力。王征等 [2] 對黑曲霉的產酶發酵條件進行優化研究,獲得316U/m1的較高酶活力。劉如石等 [3] 對黑曲霉NO.3菌株產酶發酵條件進行優化研究,最高酶活力可達144.25U/100mL發酵液,酶比活力為17.71。近期余鈞池等 [4] 采用先培養菌體后再誘導產酶的方式,在誘導劑濃度為1.5%,誘導培養基初始pH5.0,30℃培養48h的條件下,發酵米曲霉得到的單寧酶活力相當于167.4U/ml發酵液。
基因工程育種具有能定向、穩定遺傳、目的性強、育種周期短和能克服遠緣雜交的障礙等優點,國內外都開展了構建高產單寧酶基因工程菌的研究。Hatamoto O等克隆了米曲霉單寧酶的基因,用3個脫氧核糖核苷酸探針按照單寧酶N-末端和內在的氨基酸序列合成了單寧酶基因。單寧酶低產菌株米曲霉AO1被包含單寧酶基因的質粒pT1轉化后,轉化株的單寧酶活力增加了,且與轉化的質粒數成比例。陳志仕 [5] 克隆并分析了米曲霉單寧酶基因序列,構建了含單寧酶基因的載體,實現了在大腸桿菌(E.coli)和畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達。鄭穗蘭 [6] 改造了重組米曲霉單寧酶基因的表達質粒,成功地進行了基因表達框架的改造,通過轉化篩選獲得了轉化子并進行了搖瓶表達的初步摸索。ZHONG X F 等研究了米曲霉單寧酶基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達,酶活力比出發菌株提高了3倍。由于天然菌生產單寧酶主要是通過曲霉屬微生物的發酵獲得,曲霉屬發酵工藝成熟、易于大規模的培養、成本低廉、副產物少、產物分離簡單,人們也對利用重組曲霉表達系統提高單寧酶的表達進行了嘗試。如黃小鳳等 [7] 利用PCR擴增得到米曲霉單寧酶基因的編碼序列,然后將其連接到黑曲霉的表達載體ANED2-SP2上。將構建好的單寧酶基因表達載體通過原生質轉化法導入黑曲霉菌株ST31中,該重組菌株的單寧酶活力最高為104.02U/ml,比原始天然菌株提高了2-3倍。Tadashi T等將外源的DNA整合到大豆曲霉和米曲霉的染色體中,提高了在ku70 和ku80 基因斷裂過程中基因的中靶頻率,為單寧酶基因的整合提供了參考價值。
單寧酶的生產可采用固體發酵和液體深層發酵兩種方法。雖然固體發酵的設備要求比較簡單,易于推廣,但其缺點是容易污染雜菌;而液體深層發酵比較容易控制,不易污染雜菌,而且生產效率高,單寧酶的研究和生產多采用液體深層發酵的方法。