CEX和AEX的傳統工藝不能完全滿足這需求。實現該目標的一個關鍵修改是使用混合模式層析作為單抗下游平臺的一部分。混合模式層析是將疏水基團加入AEX或CEX的骨架結構中。層析填料的疏水性增強，使其在CEX和AEX模式上都得到了改善了去除多聚體的能力，更適合于單抗工藝。此外，這兩種層析方式還可同時去除HCP和DNA。不同單抗的親水性不同。因此KBI公司的平下游臺工藝被定義為陰離子交換層析（如Q葡聚糖FF或Capto Q或Fractogel SO3等疏水性填料到Captoadhere或Nuvia cPrime的混合模式填料）。這種對疏水性的調整可以為每一個單抗量身定做最佳的條件。同樣的，取決于所選的填料種類，CEX的結合和洗脫工藝也會略微或者中等程度調整疏水性。盡管該方法需要一定程度的實驗工作，如果適用于某個單抗，首選方法使用包含AEX和CEX的混合模式層析，這樣可以使用較少的疏水性固定相的用量。如圖6所示的該流程在KBI公司中包括單抗結構、細胞系和細胞培養工藝的等方面得到廣泛應用。
圖7顯示了，通過這個平臺工藝進行了大量的單抗HMW聚合物和HCPs的清除圖譜文件。從圖中可以看出，采用該平臺后，HMW的總水平小于1%， HCP低于50 ppm。特別是對于KBI公司這樣的CMDO來說，能夠廣泛覆蓋的不同結構單抗的能力是平臺的關鍵。
圖6 KBI生物制藥公司為FIH manufacturing采用的單抗下游工藝
圖7 KBI生物harma平臺DSP方法的性能。(a)HMW結果，(b)HCP結果
各種下游平臺工藝可以滿足最先進的細胞批培養的單抗生產工藝處理需要。然而，在細胞培養工藝的生產力的提高要求研發替代方法，以提高下游的生產效率。由于希望更充分地利用現有的生產設施，并希望減少生物藥的生產成本，這些技術在生物制藥領域引起了極大的興趣。最終目標是將生產的生物仿制藥的成本降低到每克10美元。
小分子藥物通常采用連續生產方法，以最大限度地提高生產設備的生產效率。然而，而傳統的生物制藥生產只能采用離散的批生產方式，包括上游細胞培養工藝和下游的層析工藝。在這方面，人們對實現生物制藥生產的持續加工的價值越來越感興趣。流加細胞培養工藝是將新鮮培養基添加到原有培養基中，并不斷提取含有產品的培養基，其主要用于不穩定或表達量低的產品。傳統的流加培養工藝僅用于培養不能在批培養中達到高水平的被抑制表達或不穩定的產品。然而，出于生產效率的考慮而不是與產品本身有關，近期流加培養工藝正變得越來越普遍。因為不需要等待細胞低的接種量中擴增的時間，而是通過一個連續的連續介質來維持在高細胞密度的生產階段，流加培養工藝可明顯提高生物反應器的生產率。需要大量的細胞培養基的缺點可在后勤上適當解決，這套系統證明花費更高的費用獲得更高的生產力合算的。此外，細胞分離技術的改進(如Repligen公司的切向流分離技術)也促進了的流加細胞培養的廣泛應用。
在連續流加培養中，產品的純化可以通過分批層析系統的多個循環來處理，這也引起了對連續的上游和下游工序的重新興趣。傳統的層析是一個批處理過程。步驟從層析柱的衛生處理，平衡，和裝載到洗滌，洗脫，脫柱和柱再生，和儲存。批處理工藝的通量和生產率是有限的。首先，由于流動分布的限制，層析柱的最大直徑只能達到2米。因壓力降的限制，填料床高度最高只能裝30厘米 (通常是20厘米)。這從根本上限制了單個循環處理產品的數量。當需要多個循環時，中間產品需要保存較長的時間。中間樣品儲存步驟也需要采用大體積的儲罐，這是對生產率的另一個限制。連續的層析分離可以把這個批處理工藝變成連續的或半連續的工藝，如圖8所示。結合一個持續的上游流加培養工藝，可以改變目前生物制藥生產工藝的設計模式。最近對連續生產工藝的經濟分析表明，連續生產工藝可以與傳統的批量生產工藝相比，采用一個大幅減小的生物反應器的生產成本基本相同。這可以顯著減少建造一個商業化生產的制造設施所需的資本支出。與2.1和2.2節中討論的一致，該法是推動以低成本生產生物仿制藥的驅動因素之一。有分析表明，即使在500L生物反應器的規模下，連續生產工藝也能達到17美元/g的低成本。
連續的層析分離可以采用多種形式進行。周期性的反流層析法是一種形式(來自GE醫療)，即采用多個層析柱在操作循環的不同階段實行連續操作。其他形式包含多柱逆流溶劑梯度凈化，采用ChromaCon公司的ContiChrom?系統、Tarpon Biosystems公司（現為頗爾公司）的BioSMB 技術從和Semba Bio公司的Octave 層析系統回收的洗脫峰的前部和尾部以增加產量以及純度。
最近在該領域的一場爭論是，為了盡可能提高的生產率，采用端到端的連續工藝是否需要以及如何實行。為實現該目標需要將多個工藝步驟，包括病毒滅活、超濾/透析和病毒過濾工藝整合為一個連續的流程。隨著時間的推移，不斷地進步的將會出現，但是否需要一個完全連續的工藝仍有爭議。將連續的細胞培養與連續的吸附層析相結合，然后通過在第3.2節中描述的高加載精制工藝完成剩余的單抗下游工序，可能已可以滿足需要。
持續生產工藝的進一步發展是不可避免的，并將導至供應商生產數量和營銷系統的數量發生改變。這一領域已經克服了一些關鍵的技術障礙，現在的重點是對這些系統進行大規模的驗證，以及使用快速的過程控制技術來改進這些系統的控制。在本文列出的新興技術領域中，因它仍選用傳統的層析填料所，連續生產似乎是第一個將大規模實現的系統。
圖8 連續層析原理
另一種提高生產率的方法是將層析工藝換為非層析工藝。對層析的依賴的一個關鍵原因是它能夠處理大量的宿主細胞蛋白雜質，同時將與產品的性質高度相似的組分的分離。然而，層析步驟是明顯的限速步驟，尤其是遇到大批量生產的產品時，比如采用大體積的生物反應器中進行高表達培養時。生物分離依賴的層析工藝，受限于層析柱的床直徑和床高度。多數層析填料是可壓縮的，這意味著裝柱時不能使用低壓泵和cGMP生物制藥的系統中使用的系統將柱子超過一定高度。此外，目前最大直徑的層析柱的直徑為2米。因此，即使有了連續的層析，載量仍然是受限的。非層析分離的設想是尋找一個代替層析的方法，一次性處理整批細胞培養收獲液的操作實現生物分離。這有可能極大地提高生物制藥的生產能力。
使用聚合物的選擇性沉淀方案可以在一次操作中捕獲整個生物反應器中的產物，而不是依賴于多個層析循環。如果這些類型的單元操作具有高度選擇性和一般性質的，它們將會在大規模的生物處理中得到廣泛應用。有多種聚合物可以用于單抗的沉淀，如陰離子高聚物沉淀產品和辛酸水解宿主蛋白雜質。不同機制的聚合物的組合可以創造出更好的選擇性。例如，鹽(高離子強度導至的沉淀)可以與帶電的聚合物結合，可以通過電荷的中和作用或者通過蛋白質分子排斥作用的聚乙二醇(聚乙二醇)實行分離。合適的組合有可能產生高度選擇性的分離，這樣就可以減少下游工序中多個連續的層析工藝的依賴，也有可能設計出具有多種機制的聚合物，實現對宿主細胞蛋白雜質或產品的選擇性沉淀。
選擇性沉淀的另一個擴展是絮凝生物反應器上清中的細胞。絮凝劑如低pH (< pH 5.0)和聚合劑,如PDDA(polydiallyldimethylammonium chloride)不僅可以用來沉淀細胞和細胞碎片,也沉淀了宿主細胞蛋白質和DNA等雜質。因此，絮凝劑在在收獲中在已其其他作用的同時，還可用于大規模去除雜質。在某些情況下可以去除大量的宿主細胞蛋白質，這樣就可以減少下游工藝步驟。
雙水相萃取(ATPS)通告向溶液中加入混合聚合物和鹽或兩種聚合物而產生兩個分離的水相。如加入PEG-鹽和右旋-PEG APTS。已有數個采用ATPS實行高選擇性分離的報道。然而，由于分區機制難以開發，而且通常不具備足夠的專屬性支持單抗之類的蛋白質的分離，所以其大規模應用受到了限制。已有一個PEG/磷酸的ATPS系統實現了從轉基因植物提取物中單抗的目的。最近，多步ATPS已經開發出來，試圖為多種不同類型的單抗創建一個統一的平臺。考慮到分離領域的需求，預計未來ATPS會有更大的發展。
所有這些分離技術都有引入關注的潛力，并且可以大幅提高現有主流生產設備的處理能力。然而，所有這些技術都需要進一步的開發，以使自己成為可擴展的技術，可以在不需要優化的情況下普遍適用于各種單抗的純化工。
除了哺乳動物細胞培養外，單抗還可以在其他表達系統中產生。進一步發展的一個關鍵領域是研究替代表達系統，該系統可以產生更高的生產力，同時保留與人類免疫系統兼容的糖基化模式。這些發展可能會使這個領域超越目前最先進的CHO細胞培養。
一個關鍵的替代表達系統是轉基因植物。其中一些系統已經用于臨床生產，例如轉基因煙草。使用土壤桿菌（Agrobacterium）瞬轉獲得轉基因煙草。這種方法被廣泛用于生產中和HIV病毒的抗體。許多公司已經開始使用煙草作為首選的表達系統(Medicago, Kentucky Bioprocessing)。然而，轉基因植物表達的挑戰仍然包括高水平的內毒素和較低的表達水平。另一種擔憂是蛋白酶的分泌，導至植物提取物的有效期縮短。此外，目前對轉基因植物生長的擔憂限制了這種技術的擴展性，大規模生產的實施有賴于公眾的認可。將轉基因植物與一般的生態系統分離的要求意味著它們的種植只能局限于大型的、自動化的溫室。這限制了這項技術的快速擴展。在這一領域進行了大量的研究，植物表達可能是未來大規模商業生產的一種技術。
大腸桿菌的胞內和胞外均可產生非糖基化單抗和抗體片段。很有吸引力的是大腸桿菌可以快速培養并達到較高的表達水平。然而大腸桿菌沒有糖基化機制，因此如果糖基化對活性很重要，這可能是限制其應用的一個重大的不足。目前，大腸桿菌主要作為單抗生產平臺的補充，僅用于抗體片段的臨床樣品生產。
酵母表達系統已被用于臨床生產。特別的是，啤酒酵母已用來表達商業多種生物療法的。然而，一個關鍵的限制是在啤酒酵母中產生過多的非哺乳動物糖基化模式。此外，由于內質網中錯誤表達和折疊，啤酒酵母的全長度單抗的表達水平受到了限制。畢赤酵母是一種較好的重組蛋白質表達系統。這是一種可以在非常高的細胞密度下培養的甲基營養酵母。在畢赤酵母系統中使用的啟動子非常強大，并且在細胞外分泌的情況下會產生顯著的表達水平(高達20 g/L)。畢赤酵母的糖基化比在啤酒酵母中要少。畢赤酵母的工程菌株消除了蛋白酶表達的問題，同時也可抑制了高甘露糖的生成。這個系統面臨的另一個挑戰是，在這個表達系統中缺少適當的蛋白質折疊伴侶。其結果是，該產品可以以多種形式存在。不過，隨著畢赤酵母的工程菌株被開發出來，這一障礙可以被克服。畢赤酵母的高產能使其成為單抗未來的候選對象表達體系。
生物制藥生產的另一個新興平臺是微藻生產系統。微藻是一種光合微生物，可在很大數量的發酵器中培養。微藻已被用于工業生物技術產品的生產。當前微藻發酵系統的產量仍然相對較低。在這個表達系統接受生物制藥生產之前，還需要克服其他障礙，包括糖基化和其他轉錄后的修飾。
本文討論了單抗平臺方法以及它在加速許多不同療法向臨床和市場的發展的必要性。使用平臺方法使許多生物制藥公司能夠在一年或更短的時間內成功地從基因中取得成功。基于它們的內部抗體結構，細胞株和細胞培養過程，每個生物制藥組織已經開發出了它最適宜的平臺方法。最新的趨勢包括使用多模態層析法作為工藝平臺的一部分，以及在一種流動模式下使用兩步精制工藝。這些工藝改進使單抗平臺的更廣泛的適用性，以及對下游處理的吞吐量瓶頸有意義。隨著細胞培養能力的不斷提高，其他可以提高下游工序生產率的替代形式也在不斷發展。這些包括蛋白質在連續模式下的操作，而不是一種批處理模式。可以想象，連續處理可以在未來的整個下游工藝中得到發展。使用沉淀或ATPS的非層析分離工藝是單抗下游工藝的另一個可能的未來方向。下一個十年將會看到單抗下游工藝平臺的進一步發展，這是基于生產力和新的分子模型的驅動。
參考文獻：
Shukla AA, Wolfe LS, Mostafa SS, Norman C.Evolving trends in mAb production processes.Bioeng Transl Med. 2017 Apr 3;2(1):58-69.