單細胞技術在藥物篩選中的應用

單細胞的異質性會被組織等高通量細胞樣本的均質化生信數據覆蓋以致難以凸顯，尤其是在臨床診斷中。所以開發應用單細胞技術在發現甚至篩選藥物靶點成為了有力的手段之一。

蘇州系統醫學研究所李貴登課題組、加州理工學院的David Baltimore課題組和西雅圖系統醫學研究院的James Heath課題組在綜合性一區期刊Nat Communications（IF:12.121）發表的“Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line”的文章。運用單細胞蛋白質組和代謝組聯合分析發現并驗證了細胞在藥物作用過程中展現出的異質性，這為單細胞技術在藥物靶標篩選方面提供了新的指導。

單細胞多組學揭示了黑色素瘤細胞系耐藥的多個獨立路徑

研究背景

已經有較多的研究證明藥物對機體細胞狀態的影響能夠從信號轉導、代謝物改變、表觀遺傳等水平上展現出來，但是對于單個細胞的的變化仍然研究不充分。

文中選用了一種高度可塑性的癌細胞系（BRAF V600E），當用靶向抑制劑治療時，它在幾天內從快速分裂的藥物反應狀態轉變為藥物耐受的緩慢循環狀態。結果表明，細胞確實可以在兩種狀態之間采取多種軌跡。每個路徑類別都有一個獨特的信號和代謝網絡，具有不同的藥物敏感性。

研究思路

 使用單細胞Barcode芯片對BRAF抑制劑（BRAFi）處理了不同時間（0天、1天、3天、5天）的樣本進行了蛋白質組學和代謝組學分析。

結果速遞

 1：BRAFi處理后的單細胞蛋白質組學和代謝組學分析與對照組（Day0）相比，某些分析物在整個細胞群中表現出高度可變性。包括黑色素細胞瘤轉錄因子（MITF、MART1）、代謝調節因子HIF1α和p-AMPKα，以及增殖標記因子Ki67。在加藥初期，葡萄糖攝取，大多數代謝調節因子和磷酸化蛋白以及Ki67表達受到抑制。在Day5組出現了藥物耐受，即與藥物抗性相關的因子表達量有所升高，如NGFR、TNFR、N-cadherin、AXL。

通過對單細胞蛋白質組學和代謝組學的聯合分析，發現了細胞先是對藥物有了初始反應，后續誘導了細胞狀態的變化，然后出現了藥物耐受的情況。

圖1 M397細胞早期藥物反應的單細胞蛋白質組學和代謝分析

2：降維分析發現藥物處理后細胞不同狀態的多重路徑文章選用了三種降維分析算法：FLOW-MAP、t-SNE和PHATE展示了藥物處理后細胞中代謝物隨時間的協調變化。

通過FLOW-MAP實現單細胞數據的可視化發現：D1時期，大多數細胞聚集在D0細胞的右上方，有小部分分布在D0的右側。隨著時間的延長，D3時候，更是如此，到D5時，所有的細胞都匯集到圖形的右側。這D1和D3細胞的分叉狀態表明了細胞耐藥過程中可能有兩條通路發生了變化。

圖2 降維分析數據結果

3：Surprisal分析解釋兩種不同路徑的聚集模塊

20種代謝物的聚集類型通過Surprisal分析得到了兩種耐藥性發展模式（圖3a）。這兩種模塊都顯示出明顯的兩種不同路徑，說明其中存在一個生物屏障。尤其是黑色素瘤細胞表型轉錄因子MITF及MART1的表達與模塊2 的評分呈現負相關表達（圖3b）。后隨即將細胞根據MITF的表達分為兩種（MITF-LOW/HIGH），并挑選了四種不同的代謝物進行了用藥后表達量的分析（圖3 h i）。結果表明，即使是相同的細胞系，在經過BRAFi處理后表現也不盡相同。

圖3 Surprisal分析表明MITF是不同路徑發生的關鍵因子

4：通過臨界點分析確定不同路徑的關鍵因子

這兩種模式都表明細胞從藥物敏感型狀態到耐藥性狀態轉換的過程中存在著關鍵臨界點。因此，文章將所有時間點的單細胞數據進行分類。通過信號網絡活動指數(SNAI)和關鍵轉換指數(Ic)分析，第7亞類和第9亞類有可能是各自路徑中接近臨界點的細胞狀態（圖4 b c）。

為了找到驅動細胞狀態轉變的關鍵調控因子，文章對第7和9亞類的臨界點代謝物進行了網絡分析和重要性得分分析（圖4 d e f）。

圖4 兩種路徑的臨界點分析和網絡分析

5：驗證導致兩種不同路徑的關鍵物質

為了確定細胞在藥物治療從敏感性轉至耐藥性的兩種可能路徑中的關鍵因子，文中選用了PKM2抑制劑（PKM2i）和NFκB抑制劑（NFκBi）聯合BRAFi治療分選得到MITF-LOW/HIGH細胞亞群，結果發現MITF-LOW組對NFκBi+BRAFi組合更敏感，MITF-HIGH組對PKM2i+BRAFi組合更敏感。同時在MITF敲除的M398細胞系中顯示出了一樣的結果。然后文中選用三種抑制劑的不同組合形式對M397進行耐藥性的實驗，發現三種抑制劑的療效明顯優于兩種抑制劑和單獨一種抑制劑的療效。以上結果表明細胞在不同路徑中對PKM2i和NFκBi表現的敏感性不同，說明這兩種通路是獨立的，有不同的調節物質在通路中起關鍵作用。

圖5 細胞中與不同通路相關的藥物敏感型差異

小結：本文選用單細胞多組學技術解析了細胞耐藥的異質性反應軌跡，更新了目前對耐藥性發展的認識，為確認有效的治療組合提供了強有力的方法學。