單細胞測序前期常見問題解答

　目前，單細胞測序這項技術被應用的越來越多，領域包括了神經科學、腫瘤免疫、胚胎發育等等，您是否也計劃著開展相關的研究呢？心中關于單細胞的疑惑就讓古朵生物帶您從常見問題出發，逐步撥開迷霧吧

　　1、為什么要做單細胞測序？

　　細胞與細胞之間的異質性，微環境里的細微差別，這些我們關注的信息都會被常規Bulk測序所掩蓋，而單細胞水平可以將細胞一一分開，找到差異。單細胞測序shou次將我們的研究拋開上帝視角，深入到細胞內部，觀察每一個細胞的差別和相似，除了基因層面，我們也可以在細胞層面和細胞類群層面進行多維度的解析。

　　2、單細胞測序對送樣有什么要求？

　　制備好的單細胞懸液或血液、組織均可，質量要求：細胞活性大于80%，細胞濃度介于5*10^5—1.2*10^6/ml，細胞總數最好大于10^5個，細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+，細胞體積需小于40μm，大于5μm。不同物種、不同組織，包含的細胞類型多種多樣。針對同一個組織，根據研究的生物學問題，對不同細胞類別的需求也是千差萬別。派森諾的單細胞懸液制備研發團隊，針對不同的物種、不同的組織類型、不同的實驗處理方式、不同的感興趣的細胞類型設計一對一高度個性化的解離方案。取樣細節、運輸細節，方方面面，為您高度個性化的研究保駕護航。

　　3、細胞懸液的制備過程中是否會影響基因的表達？

　　目前常用的方法中，不管是酶消化還是機械操作都會不可避免的對細胞產生影響，前者會使細胞產生應激反應，后者則容易損傷細胞，進而影響細胞活性。所以，在單細胞測序實驗設計時，設置對照是非常重要的。前述的這些影響，在case和control中同樣存在，我們關注case和control的差異表達基因，就可以去除實驗的系統誤差，找到決定感興趣生物學過程的關鍵基因。

　　4.、10XGenomics單細胞平臺有什么優勢？

　　一.細胞通量高，一次可捕獲上萬細胞 ；

　　二.對細胞大小及類型限制低，且捕獲效率高達65% ；

　　三.性價比高，且從懸液到文庫構建周期短。

　　5、如何判定數據質量？

　　拿到一個高質量的數據，第一步是需要獲得高質量的單細胞懸液。單細胞懸液的細胞活性，要求大于80%。目前常用的是AO/PI染色和臺盼藍染色法。相比較而言，臺盼藍染色會有一定的假陰性。針對用臺盼藍染色做的植物原生質體的活性測定，假陰性的比例會更高。因為富含葉綠體的植物細胞在臺盼藍染色后顏色更深，細胞計數儀會被判定為死細胞。因此，經驗豐富的操作人員檢查細胞狀態，也是非常重要的一步。第二步是需要捕獲到足夠數量的高質量的細胞。關于這一點的質控標準，可結合下圖做個闡釋。

　　1、捕獲到的細胞數量：這是單細胞測序研究的重要參數。捕獲到的細胞數量越多，證據越充分，越有利于發表高分文章。在后續分析過程中，會再做一次細胞過濾，最終得到的細胞數目，即是每一篇單細胞測序文章都會描述的捕獲到的細胞數目。

　　2、是細胞中的平均reads數，相當于測序深度，一般大于3萬是比較好的數據。

　　3、是細胞中的中位基因值，該值的大小與不同的組織樣本有關，如癌細胞中可能數值較高。

　　4、是測序的飽和度，一般大于50%即可。

　　5、是本次測序得到的reads比對到高質量細胞的占比，也是后續用來分析的數據。如果細胞活性偏低，細胞破裂較多，游離到環境中的mRNA偏多，這個數值會偏低。

　　6、如何判斷細胞類型？

　　細胞類型的判斷是需要您自己選擇Marker基因的，您可以參考同類物種或樣本的已發表文章，或者根據數據庫去確定Marker，比如CellMarker，panglao等。

　　細胞是生命活動的基本單位，而如今科技的發展讓我們有能力有機會去對它進行探索，去一展它的全貌，去窺探復雜生命背后的深層機制，我們相信在未來較長的一段時間內，隨著單細胞測序的發展及數據的積累，關于表型、基因型與環境之間的脈絡會越來越清晰，讓我們能更加深入的了解自然了解自己。