原代細胞復蘇技術

. 原代細胞凍存復蘇技術簡介
在ELISPOT檢測的應用中，往往需要用到凍存的淋巴細胞樣品作為檢測細胞。由于ELISPOT檢測的是細胞的免疫功能，不僅僅需要保持細胞的存活率，而且還要保證細胞的功能不發生變化。傳統的細胞凍存方法通常是為了保存細胞株，對細胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細胞原有的免疫狀態，所以傳統的細胞凍存方法已經不能滿足ELISPOT檢測的要求。參見圖7.1。
考慮到ELISPOT檢測的特殊性，荷蘭U-CyTech公司經過精心的研究與反復的驗證，推出了Cryostar?凍存試劑盒，在凍存液中添加了一系列對細胞有特殊保護作用的保護劑。達科為公司在接到Cryostar?凍存試劑盒之后，在我們的實驗室以及國內數家客戶的實驗室做了細胞凍存與復蘇的實驗，并且對復蘇之后的細胞做了ELISPOT檢測。結果表明，淋巴細胞的存活率超過90%，ELISPOT斑點形成頻率與新鮮細胞完全相同。
2. 細胞凍存、復蘇的標準程序
l 實驗儀器：
    2 可控溫度細胞離心機離心機；
    2 血球計數板或者自動細胞計數設備； 
    2 細胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”；
    2 -70°C冰箱；
    2 液氮罐；
    2 37°C水浴鍋。
l 耗材準備
    2 15ml圓錐底聚丙烯（PP）離心管； 
    2 無菌的原代細胞凍存管，2ml，外螺旋；
l 試劑配制
    2 熱失活補體胎牛血清； 
    2 R0培養基：RPMI-1640培養基，含谷氨酰胺，加入1%雙抗，不加血清。
    2 達優?無血清培養基：已經含有谷氨酰胺和雙抗，打開即用。
    2 Cryostar?重懸液(Cryostar? Resuspension Medium)：含有細胞凍存保護成分，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。
    2 Cryostar? 2×凍存液（Cryostar? Freezing Medium）：含有原代細胞凍存保護成分以及DMSO，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。