1. 將解剖用的剪刀、鑷子和刀片進行無菌消毒。
2. 將懷孕小鼠用頸椎脫位法處死，將其固定在解剖板上。
3. 用70％乙醇噴灑在小鼠的腹部進行消毒，用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內皮剪開，露出子宮，最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
4. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 mLPBS的50 mL離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復此步驟一次，留少許PBS，將胚胎轉移到另一裝有PBS的平皿中，用手術刀片將其切碎至可用微量移液器吸取。
5. 用200μL的微量移液器反復快速吹打平皿中的液體，放在15 mL離心管中， 4℃ 1500 r／min離心5 min，倒掉上清液，加10 mL胰蛋白酶，重懸沉淀，37℃水浴中消化30 min，且每隔5 min輕輕晃動，使之充分消化。
6. 將上層細胞懸液倒入一裝有10 mL DMEM培養基的50 mL離心管中，用200 目尼龍濾網過濾后，1 500 r／min離心5 min，棄去上清液。
7. 用移液管吸取30 mL DMEM培養基，讓培養液沿離心管壁緩緩流入管底， 1 500 r／min離心5 min，棄掉上清液。重復一次此步驟。
8. 將細胞沉淀用15 mL培養基懸起。細胞計數(8只14天胎鼠可獲得(2～3)×107個細胞)。
9. 將3×106個細胞懸浮于15 mL含10％小牛血清的DMEM培養基中，接種到 200 mL的培養瓶中。
10. 24 h后更換新鮮的含10％小牛血清的DMEM培養基。
11. 細胞長滿后，棄掉培養基，用PBS小心沖洗，倒掉，加胰蛋白酶消化。
12. 輕輕晃動細胞培養瓶，見有細胞浮起，立即加入2 mL血清終止消化，用移液管把細胞輕輕懸起，混勻，使細胞成為單細胞懸液。
13. 1500 r／min離心5 min。棄掉上清液。加入10 mL含小牛血清的DMEM培養基，懸起細胞，按1：5傳代。
14. 細胞再次長到覆蓋率80％～90％，將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。
15. 實驗結果：可拍照存留。 展開 | 