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  • 發布時間:2021-05-24 16:41 原文鏈接: 原位雜交(含FISH)

      原位雜交組織化學常用試劑及處理

      一、雜交前準備

      (一)DEPC水是經DEPC處理過的滅菌蒸餾水。

      DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可滅活各種蛋白質,是RNA酶的強抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中,所有液體試劑都應經DEPC處理。方法是:取市售DEPc 1ml,加入1L待處理水(蒸餾水等)中,經猛烈振搖后,于室溫靜止數小時,然后高壓滅菌,以除去降解DEPC(DEPC分解為CO2和乙醇)。有些試劑可直接加入DEPC,終濃度一般為0.1%~0.4%,原則上在雜交及其以前的步驟中,所有液體試劑均需用DEPC處理,或用DEPC水配制,包括乙醇的稀釋。此外,接觸標本以及標本有關的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。

      注意:DEPC是一種潛在的致癌物質,在操作中應盡量在通風的條件下進行,并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中,不能加入DEPC。

      (二)載玻片的處理

      組織原位雜交,常在載玻片上進行,故載玻片的洗滌至關重要,必須保持清潔,并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下:

      (1)先經洗衣粉浸泡過夜,次日自來水沖洗后,泡酸數小時以上,取出后再用流水沖洗,雙蒸水沖洗2~3次,置160℃以上烤箱中燒烤4h以上,或經15磅高壓滅菌20min。經以上處理可清除載片上的核酸酶。

      (2)HCl處理法

      (三)硅化

      【方法1】(1)將一扎新的蓋玻片散開,在通風條件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。

      (2)用去離子水沉漂洗玻片,豎放在架子上自然干燥。

      (3)硅化蓋玻片:通風條件下,將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣(dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸幾下,豎入在架子上干燥。

      (4)收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤(或培養皿)中,用去離子水漂洗數次,徹底清洗。

      (5)用鋁箔將裝有蓋玻片的培養皿包好,于180℃烘烤4h過夜。取出待冷至室溫后,即可進行后續處理。

      附:2%DMDC

      配制:按比例兩者充分混勻,靜止待氣泡消失即可使用。

      用途:硅化玻片(載片、蓋片均可)。

      【方法2】將經過洗凈的玻璃蓋片分散開放在一金屬網中,并將該網放入一接有真空泵的干燥器中。同時,在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣(dimethyldiorosilane,DMDC)的小燒杯。蓋好干燥器(確保密閉),抽真空約5min,然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網架,用錫箔紙包埋,于250℃以上烘烤4h以上,最好過夜。冷卻后備用。 

      本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃燒干。

      【方法3】APES(氨丙基三乙氧基硅浣)法

      【方法4】

      (1)49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣(DMDC)配液;

      (2)倒入每個擬硅化的試管或離心管中,浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗;

      (3)玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上,塑料器皿應于60℃烘烤過夜。

      注意:DMDC有毒且高度揮發,應于通風環境操作并戴口罩、手套,避免接觸皮膚或吸入。

      (四)載片的包被(粘貼)

      1.沾附劑

      (1)多聚賴氨酸(poly-L-Lycine,PLL)

      儲備液(0~5%)  

      按上述劑量充分混合,即為濃度為5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分裝成1ml的包裝,-20℃存放。該液為儲備液,可反復凍融,無明顯影響。用前充分混合。

      工作液(0.01%):

      充分混合,靜止待氣泡消失。

      (2)明膠液

      配法:先稱取明膠溶于500~800ml DEPC水中,加熱攪拌助溶,待明膠完全溶解以后,加入甲明礬溶解后即可使用。注意,包被玻片時,明膠液溫度最好保持在60℃左右,效果最佳。方法同PLL包被玻片。

      2.多聚賴氨酸包被玻片的制備方法(其它包被劑相同)

      (1)將事先準備好的經160℃以上烘烤,并冷卻至室溫的玻片(載片或蓋片),在0.05%(也有用0.1%)的PLL液中上下浸蘸幾下,分散開豎放在架子上,于空氣中自然干燥,4℃備用。注意:①浸蘸時,務必使整個玻片完全浸于液體中,否則,包被不完全會產生標本脫落現象;②干燥過程中注意避免塵埃污染;③按上法處理的玻片通常可存放在一定時間(室溫1月以上,4℃更長),但仍建議盡早使用。

      (2)多聚賴氨酸1mg溶于10ml滅菌的去離子水或1mmol/L的Tris-HCl緩沖液中(pH7.0),將其涂布于玻片上,待干燥后即可使用。該法包被的玻片可用于細胞涂片和切片。

      (3)將PLL工作液滴至蓋玻片上5μl/片,用另一蓋玻片以推血涂片方法推片,或用另一蓋玻片緊貼于其上,相互磨擦以使兩蓋玻片相對的一面涂布上PLL。該法制備的玻片,只有一面是包被有PLL,故制備時,待其晾干后,應作好記號,然后保存后備用。

      多聚賴氨酸可用于多種核酸雜交,方法簡單,結果可靠,有許多其它方法不可比擬的優點。配制好的液體可存放于4℃或室溫,但時間過長會解聚而失效,故建議使用時盡量新鮮配制。

      (4)Vectabond粘附劑

      該試劑是Vector公司新近推出的一種新型粘附劑。它與其它粘附劑的主要區別是:一般的粘附劑是通過物理性覆蓋在玻片表面,天長日久,可能由于包被不完全或局部脫落而致切片等標本易于脫落。而Vectabond試劑是通過化學性作用,改變玻璃表面的分子結構,使標本貼附牢固,不易脫落,且保持時間長久,耗量小,價格便宜,一個包裝7ml可配成350ml工作液使用。操作程序:

      標本(鋪片、切片等)→丙酮(5min)→Vectabond試劑工作液(5min)→dH2O(2×5min)→干燥(溫箱,數小時過夜)→用鋁箔包好,室溫備用。

      注意:制備和保存過程中避免污染。

      經上述處理的載玻片一般可存放半年以上(4℃可更長)。

      (五)硅魚精子DNA的制備

      (1)在50ml滅菌聚乙烯管中加入1g鮭精DNA,加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h;

      (2)加入2.5ml 2mol/L HCl,室溫放置,DNA形成白色沉淀,充分振搖至沉淀物相互纏繞在一起,用吸頭尖端使之形成一球團狀(2~3min);

      (3)加入5.0ml 2mol/L的NaOH。搖動小管使DNA懸浮、溶解,將小管置50℃15min助溶;

      (4)用DEPC水將混合物稀釋至175ml(總體積),充分混合,注意確保管內已無顆粒狀;

      (5)加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4);

      (6)用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH為7.0~7.5;

      (7)用無菌微孔濾膜過濾液體,去除顆粒。260nm測定溶液的OD值。


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