原位雜交實驗步驟
一質粒制備
1質粒的轉化和擴增
1.1制備XL1-Blue感受態細菌
1． 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養基的錐形瓶中，37 ℃、100
rpm培養4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L CaCl_2重懸細菌，冰浴30 min，
離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌，
分裝(200 μ／tube)，-80 ℃保存。
2． 轉化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質粒
DNA4μ1加入到8Oμ1感受態菌中。
3． 輕輕搖勻，冰浴30 min。
4．42 ℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5． 加入LB培養液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37 ℃，100轉／min水浴孵育
60 min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的
LB-氨芐青霉素50 mg／ml,1μl／ml培養基)，待菌液全部被吸收后，倒置平
板于37 ℃培養12-16h。
1.2鑒定和挑選含重組質粒的菌落
1． 用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養液的離心管
中，于37 ℃，200轉／分培養2h，取1 ml之一Eppendorf離心管，加50μl
10mmol／L EDTA(pH 8.0)。
2． 加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩
3O秒。
3． 在70 ℃溫育5 min，然后冷卻到室溫。
4． 加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5
min。
5． 12000g，4 ℃離以 3 min，以除去細菌碎片。
6． 制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，
其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進行電泳。
7． 當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2／3-3／4時，停止電泳，在紫外燈下檢查質粒
DNA分于量的大小是否與轉入質粒相符。
1.3質粒的擴增和純化
1． 用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg／ml)
培養液的聚丙烯管中，于37 ℃，200轉／分培養3h。
2． 將菌液轉入含70 ml LB-氨芐青霉素培養液的250ml錐形瓶中，37 ℃，200
轉／分培養過夜(12-16h)，細菌渾濁。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素
溶液，終濃度為170 μ／ml)。37 ℃，200轉／分培養12-16h。
4. 將培養的細菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 ℃離,th,15 min，沉淀細菌。
5. 棄凈上清夜，用2ml預冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min
6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數次后，于室溫靜置10 min。
7. 加入預冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現白色絮狀沉淀。
8． 6000rpm，4 ℃離心15 min，保留上清。
9． 將上清(若帶細菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6
倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃過夜，可
便核酸沉淀)
10.12000 rpm，4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘
兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，
充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉移至1.5 ml Eppendorf管中。
13．加入用冰預冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000 rpm，4 ℃離
心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室
溫靜置10min。
15.12000 rpm,4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘
余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，
充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉
淀，將溶液轉移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf
管中30min。
18．加入400μl 13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混勻，4 ℃ 12000
rpm離心5 min以回收質粒DNA，棄去上清。
19．加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、
酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M
的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無水乙醇，充分混勻后于4
℃放置30 min。
21．于4 ℃ 12000 rpm離心5 min回收沉淀的質粒DNA。盡可能棄去上清，敞
開管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發殆盡。
22．加入400 μl處于4 ℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm離
心2 min。
23．吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇完全揮發。
24．用100μl TE緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質粒DNA的
純度和濃度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對DNA而言其值大約為
1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質污染。；DNA濃度
=OD260 X 0.05 X稀釋倍數(μg／μl)。
26．質粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
二、cRNA探針的標記
1． 將質粒DNA，用相應的限制性內切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保
完全線性化。
2． 線性化后的DNA按“質粒的純化”步驟19-24進行純化，作為cRNA探針
標記的模板，用相應的RNA聚合酶合成地高辛標記的反義和正義RNA探
針。
3． 進行體外轉錄，步驟如下：
4． 在冰上將各試劑加入一1.5 ml無RNA酶的Eppendorf管中。
DEPC處理的三蒸水8μl
質粒DNA模板 0.05μg／μl 1μl
10 x NTP地高辛標記混合物 1 x 2μl
0.1 M DTT溶液 10 mM 2μl
5 x轉錄緩沖液 1 x 4μl
RNAse抑制劑 2U／μl 1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反應體系總體積 20μl
5． 加入上述各試劑后，混勻，簡短離心后在37 ℃孵育2h。
6． 加入2μl無RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7． 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl終止反應。
8． 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的無水乙醇，混勻，-20 ℃放置2h。