去磷酸化的平端或5凹端DNA分子的磷酸化

T4 噬菌體多核苷酸激酶

乙酸銨 EDTA 乙醇 咪唑緩沖液 聚乙二醇

液體閃爍計數儀 Sephadex G-50 離心柱 Sephadex G-50 柱

一、方法

1. 緩沖液和溶液

乙酸銨（10 mol/L）

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0）

乙醇

10X 咪唑緩沖液（500 mmol/L 咪唑鹽酸（pH 6.4），180 mmol/L MgCl₂，50 mmol/L DTT，1 mmol/L 亞精胺鹽酸，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

水配制聚乙二醇（24% m/V PEG 8000)

2. 酶和緩沖液

T4 噬菌體多核苷酸激酶

3. 核酸和寡梭苷酸

DNA (10~50 pmol，體積 ≤ 11 μl）

4. 放射性復合物

[γ-³²P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性為 3000 Ci/mmol）

5. 專用設備

可通過切侖科夫輻射定量 ³²P 的液體閃爍計數儀

Sephadex G-50 離心柱，用 TE（pH 7.6) 平衡

或

Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一個微量離心管中，按下列順序混合：

去磷酸化的 DNA         10~50 pmol

10X 咪唑緩沖液           4 μl

水                              加至 15 μl

24% (m/V) PEG          10 μl

2. 加入 40 pmol [γ-³²P] ATP (10 mCi/ml；比活性為 3000 Ci/mmol)，加水至反應終體積為 40 μl。

3. 在反應中加入 40 單位的 T4 噬菌體多核苷酸激酶。輕彈管壁以混勻試劑，37℃ 溫育反應 30 min。

4. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 以終止反應。用液體閃爍計數儀的切侖科夫計數檢測反應混合物的總放射性活度。

5. 通過以下方法分離放射性標記的探針與未摻入的 dNTP：

用 Sephadex G-50 離心柱層析

或

用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常規尺寸排阻層析

或

進行兩輪乙酸銨和乙醇選擇性沉淀放射性標記的 DNA

6. 用切侖科夫計數測量探針的放射性活度。用探針的放射性活度除以反應混合物中的放射性活度總量來計算放射性標記物轉移到 5' 端的效率。