雙光子顯微鏡活體單細胞成像揭示生物鐘發育過程

　　3月14日，PLOS Biology 期刊在線發表了題為《斑馬魚生物鐘的活體單細胞成像》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室嚴軍研究組、何杰研究組與安徽醫科大學附屬第一醫院教授李元海合作完成。該研究成功構建了可以活體實時觀測斑馬魚單細胞節律的報告基因系統，并利用該系統研究了單細胞水平的生物鐘在發育過程中是如何建立的，進而發現光照在斑馬魚的單細胞生物鐘發育中的重要作用。

　　從單細胞生物到人，二十四小時晝夜節律（circadian rhythm）是極為普遍的生物學現象。生物的生理過程和行為通過生物節律與外界二十四小時光照周期同步。在分子水平上，脊椎動物的晝夜節律主要是由核心鐘基因構成的轉錄/翻譯反饋回路產生的。在組織和器官水平上，晝夜節律由核心鐘和周邊組織的鐘組成。核心鐘被普遍認為位于哺乳動物的SCN或斑馬魚的松果體, 接受光信號的輸入，然后通過神經遞質或激素等把節律信號傳遞到周邊組織。在成年動物體內，絕大部分細胞都能在核心鐘的指揮下自主地產生節律基因的振蕩。然而，有研究表明在胚胎干細胞中，節律基因的振蕩是缺失的。這說明生物鐘的振蕩是在發育過程中逐漸建立的，但是目前尚不清楚單個細胞的鐘是如何在發育過程中建立的。斑馬魚體外受精且全身透明，非常利于活體成像研究，因此被廣泛用于動物發育研究中。很多研究表明光照對斑馬魚幼魚的生物鐘發育起著非常重要的作用。但是，外界光刺激到底是啟動了細胞內的節律振蕩，還是僅僅同步了各細胞內已經存在的振蕩，一直存在著爭議。這些問題只能通過單細胞生物鐘報告基因的活體成像解決。

　　該研究利用轉基因技術第一次成功構建了可以活體實時觀測單細胞節律的斑馬魚模型(nr1d1:VNP)（圖A）。他們使用雙光子顯微鏡對該熒光魚系進行了單細胞水平的發育時間點成像。在全腦水平，發現nr1d1:VNP報告基因的表達從松果體中的感光細胞開始，然后擴散到其它大腦區域（視頂蓋和小腦等）的細胞中（圖B,C）。通過對斑馬魚中nr1d1:VNP陽性細胞的3D重構，他們發現nr1d1:VNP陽性細胞主要分布在松果體腔周圍，而在中部則密度較低（圖D）, 同時使用單細胞RNA-seq技術鎖定了大腦中表達nr1d1:VNP細胞的分子類型（圖E）。通過對松果體進行更高分辨率的成像，他們發現大部分的nr1d1:VNP陽性細胞的表達都呈現晝夜節律振蕩疊加在發育趨勢上的特征（圖F）。最為有趣的是，在光/暗（LD）周期下，不同細胞的nr1d1:VNP表達顯示出同步的晝夜節律振蕩。然而，在光刺激缺失的全暗（DD）環境下，細部中的nr1d1:VNP晝夜節律表達被顯著抑制，但其隨發育上升的趨勢不受影響（圖G）。這些研究結果表明，發育早期光刺激是啟動核心鐘細胞內的24小時周期節律振蕩的重要開關。

　　在這項工作中，研究者首次實現了在單細胞水平下監測斑馬魚幼魚中晝夜節律基因的表達, 揭示了細胞中的晝夜節律在發育過程中是如何被逐步建立起來的。這種新的nr1d1:VNP節律報告魚系在晝夜節律研究中將有廣泛的應用，比如可以用于研究晝夜節律與體內細胞周期之間的關系、可以對晝夜節律進行細胞型特異性成像、用于篩選影響晝夜節律和睡眠的藥物等。

　　該項工作由嚴軍組高級工程師王海芳、中國福利會國際和平婦幼保健院博士楊澤勇與安徽醫科大學附屬第一醫院的李星星在嚴軍、何杰以及李元海的共同指導下完成。嚴軍研究組博士后黃登峰、何杰課題組喻曙光也做了重要貢獻。該工作得到國家自然科學基金青年項目、上海自然科學基金、國家自然科學基金面上項目以及國家自然科學基金中以合作項目的支持。

圖注: 單細胞水平揭示斑馬魚全腦細胞晝夜節律發育的過程。（A）不穩定熒光蛋白報告基因 (nr1d1:VNP) 斑馬魚模型的構建；（B）雙光子顯微鏡下觀察nr1d1:VNP在斑馬魚幼魚腦內的表達；（C）不同腦區內nr1d1:VNP陽性細胞的熒光報告基因隨斑馬魚發育的動態表達；（D）nr1d1:VNP陽性細胞在斑馬魚腦內的3D細胞密度分布；（E）利用單細胞RNA-seq分析對腦中nr1d1:VNP陽性的細胞進行分類；（F）松果體內的細胞nr1d1:VNP的表達呈現節律振蕩疊加在發育趨勢上的特征；（G）在全暗環境下松果體細胞內nr1d1:VNP節律性振蕩被顯著抑制，但隨發育上升的趨勢不受影響。