1．將已溶化的1%瓊脂鹽水管放56~60℃水浴箱中平衡溫度備用。
2．將載玻片置于水平桌面上，傾注已溶化瓊脂3.5~4ml，使成厚度約1.5mm瓊脂板。 3．凝固后，將打孔模板置于瓊脂板下，然后用打孔器打孔，根據不同需要可制成三角型、方陣型或梅花型。本次實驗采用三角型，即每一個三角型的三個孔為一組。（因本次實驗所制備的瓊脂板均以載玻片為底板故根據其大小只能采用三角型同時每一瓊脂板也只能制成兩組。否則，如采用方陣型或梅花型則因瓊脂板邊緣瓊脂厚度不夠而使周邊各孔所加抗原或抗體量不足或溢出，如制成三角型三組，因各孔相距過近相互滲透擴散而難于正確判定結果）。
4．用微量加樣器加抗體各10μl。各組所余兩孔各按抗原1、2為一組，3、4為二組，5、6為三組，分別各加入10μl。注意每加一樣品均需更換加樣器塑料吸頭，以防止交叉現象影響實驗結果。
5．作好記錄，放濕盒中，置37℃溫箱，24小時后觀察結果。