雙向電泳儀技術性能與發展

雙向電泳儀有兩向電泳組成，第一向根據蛋白質的等電點不同在pH梯度凝膠中進行等點聚焦，第二向根據蛋白質的分子量大小不同在垂直方向或水平方向進行SDS－PAGE電泳。雙向電泳儀可以將2000～3000種蛋白質進行分離。

一、蛋白質組學研究：

1、蛋白質組：

蛋白質組是指一個細胞在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的蛋白質。

2、蛋白質組學：

蛋白質組學是指研究蛋白質組的技術和這些研究所得到的結果，包括蛋白質鑒定、翻譯后修飾及蛋白質功能與疾病的關系。

3、蛋白質組學研究的意義：

蛋白質組學是連接基因、蛋白質和疾病的紐帶，對蛋白質表達變化或差異分析將具有重要的生物學意義和醫學應用價值，為闡明生命現象的本質奠定基礎。

4、蛋白質組學研究所面臨的困難：

（1）細胞種類的多樣性。

（2）細胞的生命周期。

（3）蛋白質生成的時效性。

（4）蛋白質的結構和變異。

（5）研究方法。

5、雙向電泳的重要性：

原位細胞提取與樣品處理－雙向電泳－質譜的技術路線是一條典型的蛋白質組學研究的技術路線。

雙向電泳是研究蛋白組學的關鍵技術，是深刻認識蛋白質結構和功能的重要工具。

二、雙向電泳工作原理：

雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D－PAGE）是結合等電聚焦電泳（根據蛋白質等電點進行分離）和SDS－PAGE電泳（根據蛋白質的大小進行分離）而形成的二維電泳，是分離分析蛋白質最有效的電泳手段。

通常第一向電泳是等電聚焦電泳，在細管中（Ф1～3mm）中加入含有載體兩性電解質、8M的脲酶和非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離。然后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30min，使SDS與蛋白質充分結合。將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液，使其固定并與濃縮膠連接。在第二向電泳中，結合SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離。

三、雙向電泳主要步驟：

雙向電泳是一項技術性很強并且很辛苦的工作。

1、樣品準備。

2、第一向形成pH梯度進行等電聚焦電泳。

3、第二向進行SDS－PAGE電泳。

4、考馬氏亮蘭染色或銀染色。

5、肉眼觀察或自動掃描，進行電泳圖分析。

四、雙向電泳存在的問題：

1、重復性差：方法尚未標準化，導致不同實驗室之間的結果難以重復。

2、定量困難。

五、雙向電泳的進展：

1、雙向平板電泳的進展：

（1）染色試劑有考馬氏亮蘭、銀染、同位素和熒光等。

（2）由染色檢測到直接紫外檢測。

（3）肉眼觀察到自動掃描。

2、由雙向平板電泳到雙向毛細管電泳（雙向柱電泳）：

（1）第一向為毛細管等電聚焦電泳。

（2）第二向為毛細管區帶電泳。

3、由雙向平板電泳到雙向芯片電泳。

4、由雙向平板電泳到多維電泳。