3．單鏈模板的分離
(1)沉淀M13：在上述M13培養物上清中，加入0.2倍體積的3.5mol/L醋酸銨/20%多聚乙二醇溶液，顛倒混勻數次，置冰浴30分鐘。離心15-30分鐘(11000g)可見白色噬菌體沉淀。小心除去上清液，可將試管倒置并吸去多余液體。
(2)分離純化模板：向沉淀中加入TE緩沖液100μl，輕輕混勻使沉淀重懸，(以下步驟可在微量離心管中進行)。再加等體積酚/氯仿試劑，旋轉振蕩30秒，離心1分鐘使分層。小心將上層液轉移至另—干凈離心管中。用酚/氯仿重復抽提一次并轉移上層液。
加等體積氯仿，離心，轉移上層液至潔凈管中，并重復1次。
加1/10體積3mol/L醋酸鈉(pH7.5)及兩倍體積100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分鐘，離心10分鐘，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，離心，除去上清，于真空條件短暫干燥。
加入20μlTris緩沖液溶解DNA沉淀，儲于-20℃待用。
用于測序的DNA，其A260/A280光密度比值至少應大于1.7。
[試劑與器材]
1．試劑
(1)退火緩沖液：1mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00mmol/L MgCl2和160mmol/L DTT。
(2)通用測序引物：5’-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3’，在水溶液中(5pmol/μl)。
(3)T7DNA聚合酶(8ug/μl)：在加有甘油的緩沖液中,應儲于-20℃，用時吸取1份后迅速放回。稀釋液可在4℃保存l周。
(4)酶稀釋緩沖液：20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L DTT，100 u g牛血清白蛋白/m1，5%甘油。
(5)標記用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375μm，333.5mmol/L NaCl。
(6)模板：l0μg單鏈M13mpl8DNA在50μ1Tris-EDTA緩沖液中。
(7)“A”mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/L dATP，14μmol/L ddATP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L NaCl
(8)“G"mixshort；dATP，dCTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/LdGTP，14μmol/L ddGTP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl
(9)"C"mixshort：dATP，dGTP和dTTP各840μM，93.5μmol/LdCTP，14μmol/L ddCTP，40mmol/L Tris- HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(10)"T/mixshort：dATP，dCTP和dGTP各840μmol/L，93.5μmol/L dTTP，14μmol/L ddTTP，40mmol/L TrisHCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(11)終止液：溴酚藍和二甲苯腈藍FF各3%，l0mmol/L EDTA(pH7.5)，97.5%去離子甲酰胺。
(12)標記脫氧核苷酸：[α-32P]dATP，10mci/m1，3000ci/mmol。
說明：除試劑12購自Amersham公司外，其余上述試劑均包括在Pharmacia Biotech公司的T7SequencingTMKit試劑盒內。
(13)顯影劑
(14)定影劑
2．器材
恒溫加熱器或恒溫水浴槽；渦旋振蕩器；臺式高速離心機；恒功率電泳儀；測序用電泳槽(附玻板及隔離條)蓋革計數器；可調式加樣器；微量離心管
(Eppendorf管)；膠帶；剪刀；手術刀；燒杯(100ml)；梨形瓶(100ml)；水泵；注射器(50ml)；注射器針頭(18號)；新華濾紙
(3號)或Whatman濾紙(1號)；保鮮膜；凝膠干燥器材；抽氣泵；增感屏；X光膠片；顯影及定影用具。