一、概述
報告基因 (reporter gene):是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。
一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。
在基因表達調控的研究中，報告基因被廣泛應用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。
熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發光的一類酶的統稱，哺乳細胞無內源性熒光素酶。
熒光素酶報告基因的優點
蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產生報告活性。
在所有的化學發光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發光。
檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘
二、實驗原理
利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特性，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。
同時，為了減少內在的變化因素（如：培養細胞的數目和活力的差別，細胞轉染和裂解的效率等）對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質粒（phRL-TK）作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑II (LARII)時產生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop & Glo? 試劑，將上述反應淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，同時進行第二次測量。
三、操作程序與結果判定
A．檢測前相關試劑配制
1. 1X PLB裂解緩沖液配制：將4×體積水或PBS加入1×體積5X PLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X 緩沖液，平衡需2-3 mins）。
2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：將Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后，分裝，置于-20℃避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復凍融），使用前將配好的LAR II從-20℃拿出，并平衡至室溫（需20-30min）。
3. Stop & Glo? Reagent配制：現用現配，先將Stop & Glo? Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50X Stop & Glo? Substrate加入49倍體積的將Stop & Glo? Buffer中。
B．樣品制備
1. 仔細地將生長培養基從待檢細胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細胞2-3次。此過程必須仔細，并盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）。
2. 24 孔板每孔加入100-150μl 1X PLB裂解緩沖液以覆蓋細胞，然后將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。
C．雙熒光素酶檢測方法（Promega GLOMAX） (注：系統運行時請勿觸摸操作屏)
1. 重新設定系統：Tools Settings Reset
2. 雙熒光素酶檢測程序的設定：
Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK
3. 將50μl LAR II加入1.5ml EP管中（專用的進口EP管），取10μl 細胞裂解液加入裝有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出泡），置于檢測儀，點擊“Measure” 開始讀數（為螢火蟲熒光素酶反應強度）。（使用前LAR II要混勻，并平衡到室溫）
4. 測量結束后，取出EP管，再加入50μlStop & Glo? Reagent，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出泡），再次置于檢測儀，點擊“Measure” 開始讀數（為內參海腎熒光素酶反應強度）。（Stop &
Glo? Reagent 現配現用，不能保存）
5. 記錄讀數: 每個樣品會有3個數值：RLU1——螢火蟲熒光素酶反應強度, RLU2——內參海腎熒光素酶反應強度, Ratio——RLU1/ RLU2。一般記錄Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2為實際熒光強度值，可以反映細胞的轉染效率，也可根據實際熒光強度來調整報告質粒與內參的比例。
6. 測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后，關閉儀器。
7. 實驗結果的處理與分析：采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。
四、注意事項
1. 由于溫度對酶反應有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。
2. Renilla熒光素酶檢測工作液需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存。
3. Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反復凍融，保證每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20可穩定保存一個月，在-70℃可穩定保存一年。
4. 試劑保存和使用時都應避光。
5. 為取得最佳測定效果，測定時，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應盡量控制在相同時間內（1-2秒）。
6. 使用過程中切勿接觸操作屏（程序會被終止或取消）。
7. 平時盡量不要移動儀器，防止觸摸屏走位。