分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。
雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: (a) 產物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。
材料： 待標記的DNA。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
(2)未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液 5μl
待標記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA聚合酶 4單位
DAN酶 I 1μl
加水至終體積 50μl
(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5μl EDTA終止反應。
(4) 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。
[注意]
1、3H，32P及35S標記的dNTP都可使用于探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。
隨機引物合成法
隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是：(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性,反應穩定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
材料：待標記的DNA片段。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。
(2)10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)緩沖液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。
操作步驟:
(1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf管內,水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘。
(2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未標記的dNTP溶液 1μl
10×隨機標記緩沖液 1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。
(4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16小時。
(5) 在反應液中加入10μl緩沖液A后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。
2、模板DNA應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。