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  • 發布時間:2022-10-05 20:23 原文鏈接: 雙鏈DNA探針標記法的介紹

      分子生物研究中,最常用的探針即為雙鏈DNA探針,它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。

      雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。

      切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸,將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: (a) 產物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。

      材料: 待標記的DNA。

      設備:高速臺式離心機,恒溫水浴鍋等。

      試劑:

      (1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。

      (2)未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。

      (3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。

      (4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油,50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。

      (5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。

      (6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。

      (7)10mol/L NH4Ac。

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