實驗方法原理
反向PCR是克隆T-DNA插入位點側翼DNA序列非常有效的方法。
1. 選擇合適的限制性內切酶位點。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設計引物P1、P2；
2. 回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA片段環化；
3. 回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可擴增到兩端為T-DNA插入序列，中間為側翼序列的片段。
實驗材料 DNA樣品
試劑、試劑盒 T4 DNA連接酶（T4 DNALigase）引物EcoR I ddH2O 酚氯仿無水乙醇乙酸鈉
儀器、耗材 電泳儀離心管離心機超凈臺水浴鍋
| 實驗步驟 | 一、限制性內切酶消化 1. 選擇合適的限制性內切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應對基因組DNA定量。 2. 根據T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：
1. 將酶切產物轉到1.5 ml離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250 μl； 2. 加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1 min； 3. 最大速度（13 000 rpm）離心1 min； 4. 將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1 min； 5. 最大速度（13 000 rpm）離心2 min； 6. 將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20℃預冷的無水乙醇，0.1倍體積的3 M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5 min； 7. 4℃最大速度（13 000 rpm）離心10~15 min； 8. 棄上清，盡量除去管壁上的液體； 9. 加入1 ml -20℃預冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。最大速度（13 000 rpm）離心5 min； 10. 除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發掉，20~40 μl ddH2O溶解。-20℃保存。 三、連接
2-14℃ 過夜 2. 連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進分子內的連接，減少分子間的連接。試驗中我們采取蹇文嬰等（2002）的方法（12-14℃連接48 h）。連接完成后，65℃ 水浴10 min滅活。按上述3.抽提回收，溶解于40 μl ddH2O中。
3. 然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。 |
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