實驗方法原理 標準 PCR 技術應用于定位在兩個引物之間（指向內部）的一段 DNA 片段的擴增。與此相反，反向 PCR (inverse PCR) 應用于擴增和克隆與已知 DNA 序列某一個末端相鄰的側翼的未知 DNA 序列，這種未知序列沒有引物可以利用。該項技術由幾個研究小組開發（Ochmanetal. 1988; Triglia et al. 1988; Silver and Keerikatte 1989)，包括對含有已知序列以及側翼區域的基因組 DNA 樣品用一種在靶序列中無切點的限制性內切酶消化；酶切片段（如果是總的哺乳動物基因組 DNA，這種酶切片段往往有成千上萬種）依靠分子內部連接發生自身環化；然后用這種自身環化的 DNA 作為 PCR 擴增的模板。實驗用一對與已知序列的兩端特異性結合的引物，通過二個方向向夾在中間的未知序列區域擴增。
實驗材料 噬菌體 T4 連接酶限制性內切核酸酶熱穩定 DNA 聚合酶寡核苷酸引物模板 DNA
試劑、試劑盒 擴增緩沖液ATP氯仿dNTP 貯存液乙醇酚氯仿乙酸鈉TETris-Cl
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠屏蔽型槍頭離心管正向排液式移液器PCR 儀
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
10X 擴增緩沖液
ATP ( 10 mmol/L )
氯仿
4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)
乙醇
酚：氯仿（1：1，V/V)
乙酸鈉（3 mol/L）
TE ( pH 8.0)
Tris-Cl (10 mmol/L，pH 7.6)
2. 酶與緩沖液
噬菌體 T4 連接酶（1 單位/μl）
限制性內切核酸酶
熱穩定 DNA 聚合酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠
4. 核苷酸與寡核苷酸
寡核苷酸引物1 ( 20 μmol/L) 和寡核苷酸引物2 ( 20 μmol/L）溶于水中
模板 DNA 溶于 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，內含少于 0.1 mmol/L EDTA
5. 特殊設備
自動微量移液器的屏蔽型槍頭
離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）
正向排液式移液器
PCR 儀
二、方法
1. 設計和合成寡聚核苷酸引物 1 與引物 2 是根據已知的 DNA 序列。
2. 消化 2~5 μg DNA 模板（序列復雜度小于 109 bp）應用適當的限制性內切核酸酶。抽提這種酶切消化的 DNA 樣品，應用酚: 氯仿和氯仿各抽提樣品一次；用 2.5 倍體積的乙醇沉淀 DNA 樣品，再加 0.1 倍體積的 3 mol/L 乙酸鈉；高速離心回收沉淀的 DNA 樣品；沉淀用 TE ( pH 8.0) 溶解，使 DNA 樣品的濃度為 100 μlg/ml。
3. 用一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板，依次加入以下連接反應試劑，內含濃度范圍在 0.1~1 μg/ml 的酶切消化的模板 DNA 樣品：
模板 DNA 10 ng~100 ng
10X 連接緩沖液 10 μl
1 單位/μl 噬菌體 T4DNA 連接酶 4 μl
10 mmoI/L ATP 10 μl
H2O 補足至 100 μl
反應管在 16℃ 水浴上放置 12~16 h。
4. 用酚: 氯仿和氯仿備抽提連接反應液 DNA 樣品一次。用 2.5 倍體積的乙醇和 0.1 倍體積的 3 mol/L 乙酸鈉沉淀 DNA 樣品。用高速離心回收沉淀的 DNA 樣品，用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6) 或水溶解 DNA 樣品。濃度配制成 100 μg/ml。
5. 用一只 0.5 ml 薄壁離心管，依次加入如下試劑，混合：
10X 擴增緩沖液 5 μl
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0） 1 μl
20 mmol/L 寡核苷酸引物1 2.5 μl
20 mmol/L 寡核苷酸引物2 2.5 μl
1~5 單位/μl 熱穩定 DNA 聚合酶 1.0 μl
H2O 28~33 μl
已環化 DNA 模板 5~10 μl
總體積 50 μl
6. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層加一滴礦物油（約 50 μl）防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。另一種方法是，如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置擴增離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；