反相液相色譜中流動相pH的確定

　　反相高效液相色譜緩沖體系PH的選定

　　反相高效液相色譜中緩沖體系PH值的選擇在反相高效液相色譜分析中，選擇正確的緩沖液PH值，對可離解的化合物分析的重現性十分重要，不恰當的PH值可能導致不對稱峰，寬峰，分裂峰或肩峰，而尖銳的，對稱的峰是定量分析中獲得低的檢測限以，兩次分析之間較低的相對標準偏差（RSD）和保留時間的高重現性的前提。我們將討論在使用緩沖液時如何選擇緩沖液的PH值，以及如何選擇正確的緩沖體系。

　　什么時候需要緩沖溶液?

　　在反相液相色譜分析中，流動相的PH值一般在2.5-7之間，當被分析物在反相條件下可離解，或樣品的PH值在2.5-7之外時，就需要緩沖液。在反相條件下可離解的化合物一般都有氨基和羧基，他們的Pka在1-11之間，選擇正確的緩沖液PH值可保證可離解的官能團以一種形式存在，離子形式或中性化合物的形式。如果樣品的PH值對柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和從而減小其危害。

　　如何選擇緩沖液PH值

　　在選擇緩沖液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液 PH值高于或低于Pka兩個單位，化合物中99%以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。

　　如果選擇不到合適的，樣品的pKa與流動相的pH非常接近，那么流動相pH微小的變化，都會引起樣品保留時間較大的變動。

　　當化合物只有氨基時，緩沖體系的選擇十分簡單，大多數氨基化合物在PH值小于9時都被質子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應用，你也許會問水的 PH值大約是7，為什么還用緩沖鹽，因為緩沖鹽有助于增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的減弱，減小化合物與硅膠表面硅羥基的作用，而使峰更尖銳，從表1 可值，任何緩沖液均可應用于氨基化合物的分析，但我們認為PH值等于3的磷酸鉀鹽最適合用于氨基化合物的分析。

　　在上面兩個例子中，PH=3的磷酸鉀鹽都能獲得良好的應用，在一般情況下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的緩沖液，并且我們認為在氨基化合物分析中鉀鹽比鈉鹽更好。

　　為離子對試劑選擇緩沖液

　　為應用離子對試劑的方法選擇緩沖液的過程是相似的，離子對試劑例如四丁基銨的鹽，十四烷基磺酸鈉等，在流動相中可與化合物中可離解的官能團配對，在緩沖液中以離子形式存在的化合物就需要應用離子對試劑。

　　應用緩沖液PH值來調節方法選擇性

　　如前面提到的，氨基化合物的保留隨PH的減小而降低，這個特性可以用來調節方法的選擇性，如果兩個化合物共流出，一個含有氨基，適當改變PH值就可以用來分離這一物質對。由于可離解化合物的選擇性依靠PH值，所以變化PH值也可以用來鑒別未知化合物的官能團，如果PH值變小，出峰便快，則化合物中可能存在氨基，當PH變大,化合物出峰很快，或流出在死時間處，化合物可能是一種羧酸，因為羧基離子化后流出大大快于比質子化的中性化合物。

　　總結

　　正確選擇緩沖溶液在反相液相色譜方法中對于優化尖峰，撿出限，以及獲得穩定的保留時間十分重要，如果你知道化合物官能團信息和化合物的Pka值這一過程將十分簡單。