一、用于 RP-HPLC 純化的大分子非極性多肽或蛋白質樣品的制備1.將多肽樣品（如果蛋白質是通過固相化學合成法得到的，質量在 30~50 mg 之間，盡管其量低至 mg 級，方法與其他來源的蛋白相似）在微量離心管中用洗脫液溶解（使用溶液 B，如果樣品在 30~50 mg 之間，則應用 1ml 溶液 B 來溶解；如樣品量更少，則相應減少溶液 B 的用量）。 根據多肽或蛋白的疏水性，如疏水性較大，則應提高緩沖液中乙腈的濃度，一般含有 0.1%TFA 的 60% 乙腈水溶液可以滿足要求。對可溶性很差的多肽，則需使用含有 0.1%TFA 的 90% 乙腈水溶液，或許也必須使用去垢劑、脲、鹽酸胍或 60% 甲酸溶液。詳細研究表明（Heam，1991a)，對于 RP-HPLC 中所用的許多大分子量多膚或小蛋白，溶解的最佳 TFA 濃度一般為 25 mmol/L。 2.用微量離心機離心粗提樣品，2000 g 離心 5 min，確保所有不溶物和沉淀在上樣則全部被除去。 方案 4、方案 5、方案 6 中給出了一些附加的實驗程序，這些實驗程序可獲得相當高的分辨率。 二、大分子量非極性多肽和蛋白的分析分析只需少量的樣品（50ul)。 1.采用不同型號的 RP-HPLC 吸附劑，在不同洗脫條件下，準備 5~10 份樣品來評估分離條件（如不同的流速、溫度或梯度斜率參數）。 2.每次進樣約為 5ul。 三、大分子量非極性多肽或蛋白的純化1.在每個盛緩沖液的容器中以 100 ml/min 的速度通氮氣 20 min。 該步驟的目的是除去所有氣泡，防止其進人 HPLC 體系。當體系在運打時，氣氣的速度可減小到 20 ml/min。 在整個 HPLC 體系中，保證沒有氣泡是很重要的。系統中的氣泡將導致緩沖液流速的不穩定。如果用新配置的緩沖液灌滿所有管道，則泵的壓力傳感器應該指示穩定的柱后壓。在連接好層析柱以前，每個泵抽取一些緩沖液，從而可在出口處檢查流速的穩定性。 2.接好色譜柱，先用洗脫液以 6 ml/min 的流速洗 15 min，以確保除去層析柱中的雜質，然后就可以加樣了。 3.啟動數據采集軟件，檢查檢測器是否被校準到所需波長。 對于含有芳香側鏈氨基酸的多肽可用 254nm 的波長，其他情況則可用 230nm 波長。配有光電二極管陣列檢測器為獲得不同的、衍生的、較髙階的譜線以及有效的峰軌跡跟蹤算法提供了靈活的選擇。 4.在電腦上設置溶劑洗脫梯度。 一般使用 60 mm 內梯度變化為 2%?98% 的緩沖液 B。通常在分離鄰近的峰時采用非常平緩的梯度。 5.保持上樣緩沖液 A 的流速在 6 ml/min，用手動加樣器上樣。 6.當出現多重峰時（通過色譜的高吸收值），在試管中收集小片段（1~2ul) 作進一步分析。如圖 5.11 所示。
 7.將收集到的組分分裝到樣品管中，以進行下面的分析，包括 RP-HPLC、高效毛細管電泳（HPCZE)、毛細管電色譜（CEC) 或質譜（ESI-MS 或 MALDI-MS) 等，這些分析步驟可以常規實施。一般而言，每個樣品應保留 50ul 用于評估峰純度等，而一次進樣 30ul 通常可滿足所有的分析需要。 8.如對收集到的組分進行 RP-HPLC 分析，要重復步驟①?⑥來準備 HPLC 體系，但應以穩定的分析柱代替預制柱，并將流速降低到 1ml/min，在波長為 214nm 處進行檢測。 如要進行快速分析分離，分析時洗脫時間可縮短到 25 min，重新平衡的時間為 10~15 min，以確保系統為下一次分析作好準備。 9.當制備好分析所用的組分時，就可以將樣品置于管中，在冷凍干燥機上凍干樣品過夜。
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