反相高效液相色譜5

蛋白質或多肽樣品

乙腈（HPLC級）2 -丙醇硝酸鈉硫脲三氟乙酸

分析型 HPLC 裝置色譜柱洗脫液瓶Hamilton 玻璃注射器氮氣量筒微量離心機流動相過濾裝置

一、流動相的配制

1.配制緩沖液 A(弱流動相）和緩沖液 B(強流動相）各 1L，例如：

緩沖液 A:0.1%TFA 水溶液。

緩沖液 B:0.09%TFA 的 2-丙醇溶液。

要點：用于蛋白質測序的 TFA，因其含有抗氧化劑而不適用于 RPHPLC 樣品的洗脫。

2.在備好的量筒中用 Teflon 包被的磁轉子將溶液攪拌均勻（時間視體積而定）。

3.用 0.2ul PTFE 過濾器過濾緩沖液 A 和 B。

4.將洗脫液瓶用塞子封閉，以防止有機溶劑揮發。

二、多肽和蛋白質樣品的制備

1.檢查樣品的純度。

2.如果存在不溶的蛋白、固體顆粒，則要用 0.2ul PTFE 濾膜過濾，或者離心樣品后取上清液。

三、用 RP-HPLC 進行蛋白質脫鹽

1.檢測 HPLC 系統。

（1）進空白樣（用洗脫液 A 進樣），先在 100% 洗脫液 A 中等梯度洗脫，再在 100% 洗脫液 B 中等梯度洗脫，所有條件都與蛋白樣品相同。

（2）用硫脲或硝酸鈉（或其他不會發生交叉反應的溶液，例如鹽溶液）來測量柱的死體積，從而確定鹽的洗脫時間。

2.蛋白質脫鹽。

（1）將含鹽樣品注入反相柱中，用 100% 洗脫液 A 洗脫，鹽洗脫時間接近或正好是柱的死時間。

類似的方法可用于洗脫脲、鹽酸胍等或樣品中的許多低分子量成分，以備用于還原烷基化反應后或溶解/重折疊研究。它們來源于化學衍生反應、主鏈解離或部分還原反應、亞基-亞基解離，此外還可能來源于離子交換色譜、生物特異性親和色譜或疏水相互作用色譜。

（2）用 100% 洗脫液 B—步洗脫或多步梯度洗脫蛋白。

（3）收集含蛋白的組分，以便進一步分析。