1.膠板準備
(1)膠板的清潔是灌膠能否成功的第一關鍵步驟。反復使用時要將玻璃板和間隔片上凝膠去除干凈，徹底洗凈后干燥。用乙醇擦拭玻璃板上殘留水漬。不能有一點殘留的凝膠和殘渣，否則灌膠時會產生氣泡。
(2)灌膠前要對玻璃板分別進行處理。長玻璃用親和硅烷，短玻璃用剝離硅烷處理，便于電泳結束后長短玻璃板的分離，凝膠都粘附在長玻璃板上。處理時先用剝離硅烷涂抹短玻璃，再用親和硅烷涂抹長玻璃，能不更換手套就避免親和硅烷污染短玻璃。玻璃板上不能有多余硅烷，否則干燥后會留下水印，在后續實驗如硝酸銀染色顯示條帶時會有水印痕跡，影響顯色條帶的觀察。可用鏡頭紙拭去多余硅烷。涂抹均勻后分開放置干燥玻璃，最好干燥過夜，否則會粘膠。
2.膠室制備
在凝膠灌制中膠室底部漏膠不可避免，需要準備較多的膠液以防漏膠過多而灌膠不足。膠室的制備對漏膠多少極為重要。一般膠室玻璃板間兩邊放置有間隔片而底部無間隔片，而底部是最容易發生漏膠的地方。為防止漏膠常用方法有用膠布封邊或用瓊脂糖凝膠封底。用膠布封邊時膠布一遇水就失去粘性，特別是在玻璃板的兩個底角，常封固不牢而很容易發生滲漏。用瓊脂糖封邊的不便之處為：一般變性聚丙烯酰胺凝膠面積較大，厚度常不到1mm，在灌制中如果有極小的瓊脂糖液滴不能流到底部，在聚丙烯酰胺凝膠灌注時會在殘留的瓊脂糖附近產生氣泡 ；瓊脂糖濃度偏低則凝聚時間長，延長灌膠時間，且灌制瓊脂糖時也要發生漏膠。我們參照《分子克隆實驗指南》的第三種方法：在膠室底部插入間隔片。選擇稍長于玻璃板寬度的間隔片，僅需插入1mm即可，緊密對齊兩邊的間隔片，用彈簧夾夾住。此法僅需35ml膠液就能灌制47cm×17cm×0.04cm大小凝膠，滲漏很少。凝膠凝聚后取出底部間隔片，用移液器吸取200ul左右電泳液沿玻璃板邊緣充滿底部間隙，不能留有空泡，否則電泳時凝膠下端電泳泳道會歪斜。使用該方法節約試劑，減少剩余膠液污染，操作簡便快捷。
3.凝膠灌制
采用回流灌注法灌注凝膠。因制備好的膠室有彈簧夾，將膠室放置在一水平支架上。一人操作時以靠近操作者一側膠室底角為最低點，左手托住對側玻璃板中部抬高膠室約30°。右手從低側短玻璃處緩緩灌注膠液成連續的細流，到達底部后逐步放低膠室，直至灌滿，水平放置后插入梳子，6%凝膠聚合常需1～2小時。灌膠中如有氣泡形成，調整膠室角度消除氣泡后稍放緩灌膠速度常能湊效。