吉林大學：利用CRISPR／Cas9構建轉基因豬

　　來自吉林大學的研究人員報告稱，他們利用CRISPR/Cas9系統高效構建出了myostatin (MSTN)基因突變豬。這一研究成果發布在11月13日的《Scientific Reports》雜志上。吉林大學的逄大欣(Daxin Pang)教授及焦虎平（Huping Jiao）是這篇論文的共同通訊作者。

　　開發定制核酸內切酶技術可推動構建出轉基因動物，利用它們來探究基因功能及生成人類遺傳疾病模型。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9可在特異位點導入DNA雙鏈斷裂，然后通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組來進行修復。通常，NHEJ修復過程可在雙鏈斷裂區域造成小刪除或插入基因突變。由于高效且具備快速裝配能力，在這三種核酸內切酶技術中CRISPR/Cas9成為一種更強大的工具。當前，研究人員利用CRISPR/Cas9系統已成功構建出了斑馬魚、果蠅、小鼠和猴等許多的轉基因動物。

　　Myostatin (MSTN)作為TGF-β超家族的一員，在肌肉生長中發揮負調控因子作用，其為改善家畜生長性能帶來了巨大的希望。相比野生型小鼠，MSTN基因敲除(KO)小鼠顯示出更結實的肌肉群，一些MSTN自然突變的牛品種也顯示更結實的肌肉群。以往的一些研究顯示，在進化過程中豬MSTN基因與牛和羊MSTN經歷不同的選擇壓力。有可能MSTN在豬中呈現不同的表達模式或起不同的作用。豬是世界上最重要的家畜之一，豬肉在中國的消費量尤其大。因此，構建出MSTN基因敲除豬對于調查其對肌肉發育和產肉性能的影響意義重大。

　　以往的研究報道稱，通過將Cas9 mRNA和sgRNA胞質注射到受精卵內，或利用抗生素選擇的成纖維細胞進行體細胞核移植(SCNT)來生成基因靶向豬。但這兩種方法都有缺點。共同注射Cas9 mRNA和sgRNA到受精卵中會生成具有多種表型的嵌合動物，且需要耗費時間和成本完成進一步的豬繁殖工作。來自藥物選擇成纖維細胞的遺傳工程豬往往攜帶著抗生素耐藥基因，它們正日益受到生物安全性關注。

　　在這篇新文章中，吉林大學的研究人員報告稱他們將豬胚胎成纖維細胞(PFFs)的轉染效率提高了接近90%，由此提高了靶向載體的突變效率。他們還證實了CRISPR/Cas9系統可在豬胚胎成纖維細胞MSTN位點誘導NHEJ、長片段刪除/倒置及同源指導修復(HDR)。

　　最后，研究人員通過體細胞核移植利用無選擇標記基因的Cas9/gRNA改造的成纖維細胞生成了基因靶向豬，獲得了了MSTN雙等位基因突變8只克隆小豬。一些小豬顯示明顯的肌間溝及大舌頭，這是雙肌(DM)表型的特征。相比于對照，突變克隆豬的MSTN蛋白水平下降，他們還對MSTN的mRNA水平和相關信號通路因子進行了分析。最后，研究人員仔細評估了克隆豬中的脫靶突變。

　　作者們表示，新研究中所采用的基因編輯平臺可以高效地生成生物安全性轉基因豬。