實驗概要
1. 掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳技術
2. 同工酶遺傳標記的分析
實驗原理
同工酶是一類由具有不同分子結構和大小但具有相同催化功能的酶，其分子的多種形式是由基因決定的，即基因表達的直接產物。由同一基因座的不同等位基因編碼的各種同工酶又稱為等位酶，它們從分子水平上反映了等位基因的相對差異。因此，同工酶不僅是一種生理生化指標，而且也是一種可靠的遺傳標記。
在同工酶分析和鑒定中，電泳法應用最為廣泛，它能簡便、快捷地分離某類酶的各同工酶組分，而不破壞酶的活力。電泳的支持介質——聚丙烯酰胺又是目前最常用的，它是由丙烯酰胺單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成含酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯，形成三維網狀結構。丙烯酰胺的單體和雙體的聚合有兩種類型，一種是化學聚合，常采用過硫酸胺——四甲基乙二胺（TEMED）催化系統。過硫酸胺是引發基團，供給游離氧基，TEMED是催化加速劑。另一種是光照聚合。常采用核黃素——TEMED催化系統。核黃素在光下形成無色基，TEMED放氧再氧化，產生自由基，從而引發聚合作用。制備丙烯酰胺凝膠時其凝膠的孔徑由凝膠濃度（100毫升凝膠溶液中含有單體和交聯劑總克數）決定。當采用垂直平板不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳體系時，一般上層是大孔徑的濃縮膠（pH
6.7），下層為小孔徑的分離膠（pH 8.9），電泳緩沖液為Tris－甘氨酸緩沖液（pH
8.3）。在這種不連續系統里，存在著電荷效應，分子篩效應和濃縮效應。蛋白質（酶）按其電荷效應和分子篩效應而被分離在凝膠的不同位置上。用此凝膠板與酶反應底物進行催化反應，再用生物染料染色便形成肉眼可見各種酶帶。
據研究認為以萘乙酸酯為底物的同工酶屬于羧基的酯酶類，為單體或二聚體的蛋白質。酯酶同工酶中也存在等位酶，表現出共顯性的遺傳特性。因此，酯酶同工酶可以作為孟德爾遺傳的一種分子標記。
本實驗所用的材料為我省種植面積較大的水稻品種特優63，其父母本和雜種F1酶帶有差異。酶帶的差異反映其基因型的差別。父本和母本有兩條酶帶上的差別，雜種F1是雙親這兩條酶帶的互補帶。
主要試劑
丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、過硫酸銨、核黃素、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、 HCl、蔗糖、乙醇、丙酮、維生素C、半胱氨酸、MgCl2、硫基乙醇、TEMED、溴酚蘭、堅牢藍RR、α－萘酯。
主要設備
電泳儀，電泳槽，離心機，冰箱，移液管。
實驗材料
水稻（Oryza Sativa）：龍特浦A、明恢63，特優63（F1），F2四種植株群體的幼苗。
實驗步驟
1、溶液配制
（1）樣品提取液
0.35M蔗糖、5mM vit c、3mM半胱氨酸、1mM MgCl2、5mM硫基乙酸、50mM Tris。
（2）分離膠（A:B:C:D＝1:2:1:4）pH 8.9
A、甲液（100ml）
三羥甲基氨基甲烷（Tris） 36.6g
四甲基乙二胺（TEMED） 0.46ml
1N HCl 48ml（84ml濃HCl定容至1000ml成1N HCl）
B、丙液（100ml）
丙烯酰胺（Acr）28.0g
甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.753g
C、蒸餾水
D、0.28％過硫酸胺（現用現配）
（3）濃縮膠（a:b:c:d=1:2:1:4）
a、乙液（100ml）pH 6.7
三羥甲基氨基甲烷（Tris） 5.98g
四甲基乙二胺（TEMED） 0.46ml
1N HCl 48ml
b、丁液（100ml）
丙烯酰胺（Acr）10.0g
甲叉雙丙烯酰胺（Bis）2.5g
c、戊液（100ml）
核黃素 4mg
d、己液（100ml）
蔗糖 40g
（4）電泳緩沖液母液（pH8.3）1000ml
Tris 6.0g
甘氨酸 28.8g
用時稀釋10倍
（5）前沿指示劑
溴酚藍 1％
（6）磷酸緩沖液
0.2M Na2HPO4
0.2M NaH2PO4
（7）染色液（酯酶）
磷酸緩沖液（pH6.4）90ml
堅牢藍RR 0.1g
1％α－萘酯 10ml（以少許丙酮溶解后，用80％酒精配制）
2、操作步驟
（1）清洗：玻璃板、橡膠密封圈、電泳槽
（2）裝板：將高、矮玻璃板各一片，矮板嵌入橡膠圈內圈，高板裝在外圈
（3）裝槽：將裝好的玻璃各兩組裝到電泳槽上，兩高玻璃板相對，兩矮玻璃板朝外，旋緊螺絲，防止漏膠。
（4）封邊：用滾燙的2％瓊脂沿高玻璃板的底邊灌注約0.5－1.0厘米。
（5）配灌分離膠：按溶液A:B:C:D＝1:2:1:4比例（膠濃度＝7.2％）配制分離膠，混合均勻，不要有氣泡，沿著玻璃板壁緩緩倒入電泳槽上的玻璃板夾層里到一定的高度。
（6）隔氧：在上述分離膠上立即滴一層蒸餾水，隔絕空氣，促進聚合。
（7）分離膠化學聚合：分離膠在28℃左右約30~40min可聚合，可透過玻璃看到膠與水之間出現界面時，表明凝膠已聚合好。
（8）配灌濃縮膠：分離膠聚合后，吸去上部的水分，按溶液a:b:c:d＝1:2:1:4比例（膠濃度＝3.1％），配制濃縮膠，混合均勻，灌入玻璃板夾層到頂部。
（9）制備加樣口：將1mm厚的“樣品梳子”（50個板品）插入濃縮膠溶液中。
（10）濃縮膠光照聚合：將灌制好的凝膠板置于自然光照條件下（或40W日光燈下）聚合1小時左右。直到界面出現乳白色，說明濃縮膠已聚合好。
（11）制備樣品：取2厘米左右的水稻幼苗于0.5ml的Eppendorff管中，加入樣品提液70~80ml，用搗樣器搗爛后，離心后置冰箱備用，每組制備龍特浦A、明恢63、F1各5株樣品，F2樣品85株。（制備的每個樣品插于塑料泡沫內）。
（12）加樣：將濃縮膠上端的“樣品梳”小心取出（若樣品孔中有多余水份，用注射針吸干），每一樣品孔，按順序用移液槍加入15μl的上述制備的樣品。
（13）穩壓穩流電泳：在電泳槽的內層（正極）和外槽（負極）應加入Tris－甘氨酸電泳緩沖液（母液稀釋10倍），負極方向的電泳緩沖液量應超過其玻璃板（矮板），電泳槽的正負極與電泳儀的正負極要對應連接。插上電源，調整電壓到220v，并使之處于穩流狀態。在電泳槽的負極處滴兩滴1％溴酚蘭，作為電泳的前沿指示劑。待前沿指示劑離凝膠板底部1厘米時，停止電泳，即調整電壓到0點，關掉電源開關，取下電泳槽的電極連線。
（14）卸凝膠板：倒去電泳槽中的電泳緩沖液，旋松螺絲，卸下兩組玻璃凝膠板，去掉橡膠密封。
（15）剝離分離板：輕輕撬開每組玻璃凝膠板的高低兩片玻璃，去除凝膠板中的上部濃縮膠和底部的封邊瓊脂。小心剝離分離膠于染色缸中，或將帶分離膠玻璃板浸泡于清水中，利用水的浮力剝離分離膠。然后再將凝膠小心滑入染色缸中。
（16）染色：將0.2M磷酸緩沖液（pH6.4）90ml和1％α－萘酯10ml倒入染色缸中。37℃輕輕振蕩，讓分離膠與底物充分接觸起酶促反應，10分鐘后加入生物染色劑堅牢藍RR 100mg，繼續振蕩，直到酶帶清晰為止（染色不要過長）。
（17）觀察紀錄：染色好的凝膠倒去染色液，用清水洗3~4遍，置于透光箱上觀察酯酶同工酶的酶帶，及其變化情況。