最早檢測同型半胱氨酸是氨基酸分析法，Ueland等測定血清中同型半胱氨酸，后經改良，常用方法包括以下幾種。
同位素法：由Refsum等1985年建立的方法。該方法通過14C標記的腺苷與HCY縮合后，經色譜分離，液體閃爍計數放射強度來測HCY濃度。該方法靈敏度高，特異性強，但操作繁瑣且有放射污染，未能推廣使用。
色譜法：1987年Stabler首先報道了氣相色譜——質譜法測定同型半胱氨酸。該法可同時測定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多種物質。雖然靈敏度、特異性好，但儀器價格昂貴而不能推廣。高效液相色譜法（HPLC）是比較成熟且推廣使用的方法，不足之處是樣品處理、層析條件、樣品檢測及定量的諸多變異，使其難以標準化。Fiskertrand等首先于1993年用全自動高效液相色譜法對血漿和尿液的HCY和硫醇物進行測定。HPLC根據衍生方式（柱前或柱后衍生）、檢測方法（熒光、電化學）可分為多種方法。應用HPLC準確測定同型半胱氨酸需要優良的設備、高超的技術經驗和應用HPLC方法適當的時間，另外選擇和制備內部質控也相當重要。
免疫學法：該法應用特異性的抗S-腺苷同型半胱氨酸單克隆技術，采用熒光偏振法或免疫法測定HCY.美國雅培公司采用全自動化學發光免疫分析技術，用Architect I2000SR儀器檢測HCY，反應原理為：正常人血漿中HCY約1%以還原型存在，70%與白蛋白結合，30%形成小分子二硫化物。血漿標本在含二硫蘇糖醇的預處理液作用下，HCY、混合的二硫化物及蛋白結合型等均被還原成游離HCY形式（tHCY）：tHCY在S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）水解酶和過量腺苷存在下，被轉換成SAH；預稀釋的SAH混合物、抗-SAH單克隆抗體及標記的熒光S-腺苷-L-半胱氨酸示蹤物一同孵育，儀器自動檢測偏振光的改變，即可測出標本總HCY水平。此方法快捷、操作簡單、自動化程度高，可減少人為誤差，具有良好的準確度與精密度，適合大多數臨床實驗室應用。