同源重組技術原理：
基因敲除鼠技術是上世紀80年代中后期基于DNA同源重組的原理發展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據同源重組（homologous recombination）的原理，首次實現了ES的外源基因的定點整合（targeted integration），這一技術稱為"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫學獎。
同源重組（homologous recombination）定義：是指發生在姐妹染色單體（sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。在基因敲除小鼠制作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設計帶有相同片段的重組載體，將重組載體導入到胚胎干細胞后外源的重組載體與胚胎干細胞中相同的片段會發生同源重組，如圖1所示：
制作流程：
圖2. 基因敲除鼠制作過程示意圖
1、Knockout載體設計與構建
根據研究項目具體情況和要求把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 片段都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體。
2、Knockout ES細胞篩選
Knockout載體測序驗證正確后，將載體線性化，然后電轉入ES細胞，通過載體上的正負篩選基因獲得陽性的Knockout ES克隆。選取PCR鑒定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用于Southern Blot鑒定，將Southern Blot鑒定的Knockout ES擴大培養并液氮保存。
3、Knockout ES細胞囊胚注射得到嵌合體小鼠
擴增經鑒定插入或置換片段位置正確的Knockout ES細胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數量的Knockout ES細胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，通過小鼠的毛色中來源于ES細胞毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。
4、由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout 小鼠
將嵌合體小鼠與適當品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通過PCR方式檢測小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。
5、Knockout小鼠生殖系傳遞鑒定
將嵌合體小鼠和適當品系野生型小鼠交配，通過后代小鼠毛色或PCR基因型鑒定的方法驗證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。