實驗方法原理 本方案用磷酸酶去除核酸的 5' 磷酸根，然后在 T4 噬菌體多核苷酸激酶的催化下，以放射性標記的形式重新將磷酸加到核酸上，這是一種廣泛應用于 32P 標記探針的技術。
實驗材料 T4 噬菌體多核苷酸激酶DNA
試劑、試劑盒 乙酸銨EDTA乙醇T4 噬菌體多核苷酸激酶緩沖液
儀器、耗材 液體閃爍計數儀Sephadex G-50 離心柱Sephadex G-50 柱
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙酸銨（10 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0 )
乙醇
2. 酶和緩沖液
T4 噬菌體多核苷酸激酶
10X T4 噬菌體多核苷酸激酶緩沖液
3. 核酸和寡核苷酸
DNA (10~50 pmol)
4. 放射性復合物
[γ-32P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性為 3000~7000 Ci/mmol）
5. 專用設備
液體閃爍計數儀，可通過契侖科夫輻射測量 32P
Sephadex G-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡
或
Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡
二、方法
1. 在一個微量離心管中混合下列試劑：
去磷酸化的 DNA 10~50 pmol
10X T4 噬菌體多核苷酸激酶緩沖液 5 μl
10 mCi/ml [γ-32P] ATP
( 比活性為 3000~7000 Ci/mmol) 50 pmol
T4 噬菌體多核苷酸激酶 10 單位
水 加至 50 μl
37℃ 溫育反應 1 h。
2. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 以終止反應。用液體閃爍計數儀中的契侖科夫計數測量反應混合物中的總放射性。
3. 通過以下任一方法分離放射性標記探針與未摻入的 dNTP：
用 Sephadex G-50 離心柱層析
或
用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常規尺寸排阻層析
或
用乙酸銨和乙醇對放射性標記的 DNA 進行兩輪選擇性沉淀
4. 通過契侖科夫計數測定探針制品中的放射性量，用探針中放射性含量除以反應混合物中的放射性總量來計算放射性標記物轉移到 5' 端的效率。