1.4 利用載體或接頭的染色體步行技術克隆基因啟動子
這類方法的第一步都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭，既可以用pUCl8等質粒載體，也可以使用λDNA等噬菌體載體，只要選用的載體帶有合適的酶切位點；同樣根據實驗需要，接頭既可以是雙鏈也可以是單鏈，然后根據基因組DNA序列設計的特異引物和載體的通用引物或接頭序列進行擴增。
1.4.1 利用載體的PCR Shyamala等利用的單特異性引物PCR(SSP-PCR)對以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉運操縱子為起點進行連續步行。以M13mpl8RF DNA為載體。用PstI和AraI酶切基因組DNA，PstI和XmaI酶切載體DNA，然后連接基因組片段和載體片段，用根據基因組DNA序列設計的特異引物和載體的通用引物進行擴增，由于非特異片段沒有單特異引物結合的位點，即使有載體連到非特異片段，也無法得到大量擴增，而使特異片段得到有效擴增。
1.4.2 利用接頭的PCR王新國等利用銜接頭的方法，設計了位于單鏈DNA兩端互補的顛倒末端重復序列，增加了反應的特異性，在胡蘿卜II型轉化酶基因啟動子的克隆方面取得了新的進展。首先將胡蘿卜基因組DNA分別用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV酶切，并設計了1個銜接頭長鏈序列和1個銜接頭短鏈序列，并在銜接頭短鏈的3'末端帶有1個氨基的銜接頭，能夠阻止聚合酶催化的銜接頭短鏈的延伸，同時銜接頭的長鏈和短鏈之間是反向重復序列。將酶切片段與此銜接頭連接，取連接產物做模板，以銜接頭引物和基因特異引物做PCR，在首輪PCR中只有限定的遠端基因特異引物有結合位點，當基因特異引物延伸產生的DNA鏈通過銜接頭時，才能產生銜接頭引物的結合位點，PCR才能以銜接頭引物和基因特異引物進行指數擴增。而另一方面，如果非特異合成產生了DNA兩端都有雙鏈銜接頭序列的PCR產物時，這種PCR產物在每次變性后，單鏈DNA末端的銜接頭反向重復序列將形成鍋柄結構，此結構比引物-模板雜交更穩定，能抑制非特異序列的指數增長。最后得到主要的PCR產物為3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。將EcoR V-銜接頭體系的PCR產物克隆、測序、同源性比較，得到1個新的胡蘿卜II型轉化酶基因啟動子序列，它含有類似于TATA box和CAAT box的元件，在啟動子的遠上游區域含多個AT富含區，該啟動子的發現對于研究植物中的糖代謝具有重要的意義。接頭引物的相對位置如圖3所示。
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這種方法具有便于操作、實驗線路簡單的優點，但是特異性較差，產物需進一步雜交驗證。
1.5 YADE法
Prashar等在擴增cDNA3'端時采用“Y”形接頭，以減少接頭引物的單引物擴增。
其原理是接頭引物處于“Y”接頭的2個分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導合成了接頭的互補序列后，接頭引物才能退火參與擴增，流程如圖4。
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方衛國等嘗試將YADE法引入到昆蟲病原真菌的分子生物學研究，并取得了成功，建立了適合于球孢白僵菌和金龜子綠僵菌YADE體系。在已克隆的類球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基礎上，利用YADE法，克隆到該基因的啟動子CDEPP。
先酶切球孢白僵菌基因組DNA，然后與“Y”形接頭相連，取連接產物做模板，先以基因特異引物1做線性擴增，再以線性擴增產物為模板，以接頭引物和基因特異引物2做指數擴增，只有當線性擴增時合成了含有接頭引物的互補單鏈，接頭引物才能與其發生退火，參與指數擴增，從而有效防止了接頭引物的單引物擴增。最后得PCR產物，進行序列分析確定為CDEP-1的上游啟動子序列。
在應用YADE法時，內切酶的選擇至關重要。好的內切酶產生適合PCR擴增的片段，太大太小都不行。為了得到合適的內切酶，需要從眾多的內切酶中篩選。研究表明，不同的物種有自己合適的內切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因組 DNA片段，也可以是cDNA片段，在延伸cDNA片段時，設計的引物需要避開內含子和外顯子的邊界，在內含子的位置未知的情況下，可考慮多合成1～2條特異引物，以提高擴增未知片段的機率。該方法假陽性低、效率高，理論上能擴出所有目的片段。