基本方案
| 實驗方法原理 |
平衡滲透的原理可以通過經典的實驗來驗證。牛血清白蛋白（BSA）是一種比較廉價的大分子物質，可以大量獲得。因此可以用不太靈敏的方法來測定，而無需化學轉化或放射性同位素標記。結合常數 Kd 和每個白蛋白分子上的結合位點數 n 都能有效精確地獲得。然而由于這種實驗方法的原因可能引起誤差，實驗時必須小心謹慎以減少所得數據的誤差。這個實驗可以和其他實驗一起進行，像超濾和超速離心等。 血清白蛋白是血液中一種必需的運輸蛋白，具有獨特的結構，由一系列重復的單位組成，并最終形成三個相似的結構域，每個結構域上都有由脂肪酸、像膽紅素的膽汁色素和色氨酸的結合位點（Peters，1985）。后面的結合位點可以通過這個實驗來鑒定，吲哚環可以取代氨基酸。這個復合物可以用 Ehrlich's 試劑來進行定量分析，形成薔薇吲哚（rosindole）發色團（圖 1）。
|
|---|---|
| 實驗材料 | 牛血清白蛋白 吲哚 |
| 試劑、試劑盒 | 磷酸鉀 KOH 甲苯 乙醇 Ehrlich's 試劑 |
| 儀器、耗材 | 透析膜 訂購的透析管 透析設備 光度計 玻璃比色皿 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 吲哚測試和標準曲線 把 0.25 ml 吲哚溶液（用 0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸鉀稀釋母液）、10 ul 5 mol/L KOH 和 1 ml 甲苯分別加入到 1.5 ml 反應杯中。充分搖晃反應杯，然后離心 5 min。取 0.2 ml 上層的有機相加到一個新的反應杯中，并加入 1.2 ml 稀釋的 Ehrlich's 試劑。樣品混合后在室溫下可放置 20 min，用分光光度計在 572 nm 或 578nm 下測樣品的吸光度。用 0.25 ml 0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸鉀代替吲哚做空白對照。 標準曲線通過 10 個不同的吲哚濃度和 1 個空白對照繪制出，由標準曲線可讀出透析實驗中不同的吲哚濃度。 2. 透析膜的處理方法 在實驗前必須先將透析膜切成足夠大的小片，使它能完全覆蓋透析單元間的空腔。由于透析袋是雙層的，所以必須先將透析袋從側面切開。在使用膜片前需要先在加了 EDTA（約 5 mmol/L ）的水中煮上 5 min 來完全去除重金屬離子。然后用水洗透析膜，再放在透析單元中間。為了使透析膜保持濕潤，在插入膜片后應迅速使透析單元充滿溶液。 3. 最少透析時間的確定 準備十個透析單元，每個單元都由兩部分組成，中間以透析膜隔開。每個單元右邊的小室加 1 ml 5×10-4 mol/L 溶于 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸鉀的吲哚溶液，左邊的小室加 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸鉀溶液。此步操作必須迅速，然后固定到旋轉器上開始透析。在一定的時間間隔后，從第一個透析單元左右兩邊各取出 0.25 ml 的樣品，在第二個同樣的時間后再從第二個透析單元取同樣的樣品，依次類推，直到取完所有的透析單元的樣品。所有的樣品，連同透析前的初始吲哚溶液一同用于吲哚測試以決定濃度。左右兩邊樣品的吸收值分別對時間作圖，作出兩條曲線，兩條曲線相交處的時間可以作為最小透析時間，用于下面的實驗。實驗的時間間隔和總的時間依賴于特定的透析條件，特別是透析設備。通常應該在 2 h 內達到透析平衡，這也是實驗的總時間。由于配體濃度呈指數改變，推薦使用不同的時間間隔，在實驗開始時時間間隔短，在實驗快結束時采用長的時間間隔。 4. 吲哚與血清白蛋白結合的測定 與上面一個實驗一樣至少準備 10 個透析單元。在每個圓柱體的一側（比如右側）加 1 ml 0.1 ml 的牛血清白蛋白（溶于 0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸鉀中）。另一側（左側）加滿吲哚溶液，濃度范圍為 2×10-5～2×10-3 mol/L 在實驗前把溶液稀釋好。通常結合實驗的終濃度（即吲哚在兩側分布引起的雙重稀釋）應平均地分布在一個范圍內，一個數值在分離常數以下，一個在以上（吲哚 Kd＝0.08 mmol/L ）。但是由于這些濃度與平衡中的自由成分 ［A］ 相關，為了分享結合成分，必須使用適當高濃度的配體。透析必須在常溫下進行（25℃）。在透析結束（確定的最小滲透時間加上 30 min，要確保滲透平衡和蛋白已結合）后，所有小室溶液耗盡，從而確定吲哚濃度。
展開 |
| 注意事項 | |
| 其他 |
1. 材料 0.1 mmol/L 牛血清白蛋白（Mr＝68 000；68 mg 溶于 10 ml 0.1 mol/L 磷酸 pH 7.0） 0.1 mmol/L 吲哚（Mr＝117.2；1.17 g 溶于 100 ml 異丙醇，用 0.1 mol/L 磷酸鉀 pH 7.0 進一步地稀釋） 2. 試劑 0.1 mol/L 磷酸鉀 pH 7.0 5.0 mol/L KOH（Mr＝56.1；28 g 溶于 100 ml 水） 甲苯 乙醇 Ehrlich's 試劑：把 9 g 對二甲氨基苯甲醛溶于 205 ml 乙醇并緩慢加入 13 ml 濃硫酸（戴護目鏡操作），用乙醇定容到 250 ml。使用前用 2 份乙醇稀釋 1 份試劑（只儲存濃縮試劑，室溫下可儲存數月）。 3. 耗材 透析膜，訂購的透析管（例如 Visking） 透析設備（如上描述，由 10～20 個透析單元組成，每個單元有兩個 1 ml 的圓孔，圓孔直徑 12 mm，高 9 mm）。 光度計（可見光波長范圍） 玻璃比色皿
展開 |
