實驗86 吸收光譜分析
光譜分析可以分為發射光譜分析和吸收光譜分析兩大類。當構成物質的分子或原子受到激發而發光，產生的光譜稱為發射光譜，發射光譜的譜線與組成物質的元素及其外圍電子的結構有關。吸收光譜是指光通過物質被吸收后的光譜，吸收光譜則決定于物質的化學結構，與分子中的雙鍵有關。各種物質由于具有不同的生色團（chromophore），如烯基，炔基，酮基，醛基，羧基，酰胺基，硝基，偶氮基等，因此也有不同的吸收光譜曲線。我們就可以利用吸收光譜來鑒定一些復雜的物質，如利用紅外光譜進行物質結構的分析，也可利用吸收光譜的最大值進行定量分析。
Ⅰ．比色分析法
原理
比色分析法和分光光度法在植物生理學中應用十分廣泛，由于它方法簡便，分析速度快，靈敏度較化學容量分析和重量分析要高，所以樂為人們所采用。其基本原理是根據物質對光的吸收，吸收的光量與物質的濃度、溶液的厚度成比例關系，這就是著名的蘭伯特—比耳（Lambert－Beer）定律，它們之間的關系可用數學公式表示為：
IT =I0 ×10-KLC (1)
式中I0 為入射光強度，
IT 為透過光強度，
L為溶液的厚度，
C為溶液的濃度，
K為吸收系數，表示物質對光的吸收特性，不同物質K值不同。
份數，以T表示之，單位常用%。
A=KLC (2)
對于一定的溶質，K值是相同的，如果測定時溶液的厚度固定，即L不變，從(2)式可見，溶液的濃度C與吸光度A成正比例。所以只要測得吸光度A，就可以計算濃度C。用比色計就能很方便地測得吸光度A，儀器的讀數盤上總有兩項數目，一是等距離標尺的透射比T，另一是不等距離的對數標尺吸光度A，一般總是讀取T，從附表9查得A，而不直接讀取A，以減少讀數誤差。
濾光片的作用及選擇
一般溶液對各種波長的光的吸收是不同的，只對很狹窄的一部分光波吸收最強，其他光波則通過溶液。濾光片的作用即在于使得光源來的各種波長的光，只讓最容易被溶液吸收的光波通過，而濾去不被溶液吸收的光波，使光更接近單色性，使其更符合蘭勃特—比耳定律，提高分析的靈敏度。為了要得到單色光可以在光源和溶液之間加一濾光片，因而選擇合適的濾光片是很重要的，選擇的原則是，濾光片透光度最大的波長，應該是溶液透光度最小的波長（即吸收最大的波長），濾光片的顏色應該是溶液的補色。下表可供選擇濾光片時參考。
如果象581—G型比色計，只有3塊濾光片，NO．42藍色，NO．50綠色，NO．65紅色，是絕對不會用錯的。如果象72型和721型分光光度計，不用濾光片，代之以更精密的單色光器，則比色波長的選擇，可根據溶液的吸收光譜曲線來決定。先行繪制比色溶液的吸收光譜曲線（方法可參照實驗32），以出現最大吸收峰時的波長作為比色測定的波長。例如用度計上測得吸收光譜曲線如圖31，最大吸收峰位于520nm，以后比色時即用波長520nm。
此外，國產比色計或分光光度計，每臺儀器都配有一盒比色杯，比色杯的光徑有5、10、20、30、50mm等規格，以4只為一組，每組之間的透光性是比較一致的，不要和其他儀器上同光徑的比色杯調用，如果要互用的話，應測量一下它們的透光性是否一致。每只比色杯的磨砂面上都標有一箭頭，插入架子比色時，應面對箭頭方向，以減少誤差。最常用的為光徑10mm的一種，也是標準比色杯。
繪制標準曲線
根據公式A＝KLC，K和L不變對，則吸光度A與溶液濃度C呈正比例關系。所以將濃度為Cs 的標準樣品與濃度為Cx 的待測樣品，放在兩只光徑相同的比色杯中（標準情況下使L=10mm），測得兩溶液的吸光度分別為As 和Ax ，根據上式則它們之間有如下關系：
As ：Ax =Cs ：Cx (3)
這就是比色分析中最常用的一個運算公式，用以計算未知溶液的濃度。但公式的應用受溶質的性質和呈色反應的機理以及試驗條件等影響，實用時特別是溶質濃度高時，就不完全符合公式。所以應用這一公式進行比色分析時，往往是用一系列不同濃度的標準溶液，在比色計上測得相應的吸光度A，然后在毫米方格紙上繪制吸光度—濃度曲線（即A—C曲線），以后測定未知樣品時，只要在同樣條件下測得吸光度A，便可以在標準曲線上查得樣品的濃度。但在繪制標準曲線時，不同濃度的吸光度值往往不會完全落在一條直線上，此時要決定直線的斜率就會感到困難，因此最好應用統計方法配以回歸直線方程式Y=a bX，只要求得a和b（用具有統計模式的計算器很容易計算），方程式即可解。以后就可以利用此方程式進行計算，比查圖要方便，也精確得多。
式中X為溶液的濃度，
Y為溶液的吸光度，
N為測定的項數，即所用標準溶液的數目，
a為直線在Y軸上的截距，
b為直線的斜率。
繪制標準曲線時的試驗條件及步驟，也就是以后進行比色分析時的標準。選擇確定條件時，應特別注意：生色的條件、顏色的穩定性、線性濃度范圍以及比色波長等。生色的條件是與反應機理有關的問題，而溫度對反應速度的影響是很顯著的，應該十分重視反應時溫度的高低的時間內高溫下所產生的顏色可以1倍于低溫下所產生的顏色，因此不同溫度下標準曲線的斜率也就不同，靈敏度也就不同了。
光、溫度等關系密切，也應注意。線性濃度范圍則由于不同的物質和所用的方法而異。
Ⅱ．紫外和可見分光光度分析
原理
在比色分析中的入射光源是通過濾光片，得到波長范圍較寬的重點單色光，如果用單色光器代替濾光片，得到了波長范圍更為狹窄的單色光，作為入射光源，使更符合Lambert—Beer定律，大大地提高分析靈敏度，擴大了它的應用范圍，這就是分光光度法。在可見光區此時的分光光度計實際上可以看作是一個波長可調、具有高分辨率和高靈敏度的高級類型比色計。如果采用合適的光源和分光器，還可以將波長范圍擴大到紫外光區和紅外光區。相應地就有紫外分光光度分析和紅外分光光度分析。
各種物質由于其分子結構不同，它們的吸收光譜曲線也有其特殊的形狀，我們就可以利用物質的特征吸收峰，對該物質進行定量分析，而不必將它從混合物中分離，這就大大地簡化了測定手續，特別是要分析混合物中兩個或兩個以上組分時，尤為方便，這是一般比色分析所不能達到的。用分光光度法測定葉綠素a和b，就是我們熟悉的一個例子。
測定單一組分
如果溶液中只有一個組分，而該組分有一明顯的吸收峰，如圖34ATP在pH=2的溶液中的最大吸收峰為257nm，只要將未知濃度的ATP溶液，在分光光度計波長257nm時測得吸光度A，然后根據公式即可進行計算。
根據公式(3)，有如下關系：
式中Cs 和Cx 分別為標準樣品和未知樣品的濃度。
As 和Ax 分別為標準樣品和未知樣品的吸光度。
如果濃度的單位為摩爾濃度，例如Cs =1mol/L，而溶液的厚度為1cm，則此時的吸光度A稱為摩爾吸收系數，以ε表示之，則As =ε，所以上式即成為：
式中摩爾吸收系數ε，系指某物質當濃度為1mol/L時，比色杯光徑（即溶液厚度）為1cm，在它的最大吸收波長λmax 下測得的吸光度值，文獻上常以εmax 表示之。
從(4)式可見，只要知道某一物質的εmax ，并測得其未知濃度溶液的Ax ，則未知樣品的濃度Cx ，即可以計算得到。而摩爾吸收系數ε可以從生化手冊或文獻中查到，附表10即為核苷類化合物的光譜數據。
一般應用公式(4)作分光光度分析，有時也用比吸收系數k代替摩爾吸收系數ε，則式(4)可改寫為下列形式：
k的含義為，某物質的濃度以%為單位，比色杯光徑為1cm，在最大吸收波長λmax 時的吸光度A，稱為比吸收系數k。
應用ε或k，雖然沒有標準樣品，都能進行分析測定，但應該注意的是應用公式(4)或(5)進行分光光度分析時，測試的條件必須與測定ε或k時完全一致。但實際上往往不能做到完全一致，所以最好還是用標準樣品，在試驗條件下，求得ε或k值，以后未知樣品就在這樣的條件下進行測定。
測定兩個組分
如果要測定混合液中兩個組分時，倘若它們的吸收峰有著明顯的差異，彼此又不發生干擾，這時就可以象分析單一組分一樣進行測定。如圖35為兩種化合物S和R的吸收光譜曲線，它們的吸收峰分別在420nm和565nm，吸收峰彼此獨立，不產生干擾，這時就可以象測定單一組分一樣進行分析。值得注意的是，由于S在420nm的吸收峰較陡，測定時波長稍有不正確就會帶來很大的誤差，在這種情況下還不如利用較平坦的肩峰450nm進行測定，就不會因為波長不準確引起誤差了。R化合物的565nm吸收峰較平圓，情況就要好得多了。
一般情況下兩個組分的吸收峰彼此不產生影響的情況是少見的，通常情況往往是吸收峰彼此總有些重疊，如圖9中葉綠素a和b的吸收光譜曲線，在葉綠素a的吸收峰位置（663nm），葉綠素b也有吸收，同樣在葉綠素b的吸收峰位置（645nm），葉綠素a也有吸收，彼此產生干擾。在這種情況下，需要通過代數方法，計算一種組分由于另一組分存在時的吸收作用。其方法是需要在兩種波長下（一般為這兩種組分的最大吸收峰波長），測定混合液的吸光度，然后通過計算，即可以得到混合液中這兩種組分各自的含量。
設選用的兩個波長分別為λ1 和λ2 ，組分a和b在波長λ1 時的吸光度分別為Aa1 和Ab1 ，在波長λ2 時的吸光度分別為Aa2 和Ab2 。a和b的濃度分別為Ca 和Cb ，若濃度為摩爾濃度，則組分a和b在波長λ1 時的摩爾吸收系數，分別為εa1 和εb1 ，同樣在λ2 時的摩爾吸收系數為εa2 和εb2 ，同樣道理其比吸收系數則分別為ka1 、kb1 、ka2 和kb2 。
根據公式(4)，在波長λ1 時則有：
Aa l=Ca ·εa1
Ab1 =Cb ·εb1
根據公式(5)，則有：
Aa1 =Ca ·Ka1
Ab1 =Cb ·Kb1
同樣在波長λ2 時，則有：
Aa2 =Ca ·εa2
Ab2 =Cb ·εb2
或 Aa2 =Ca ·Ka2
Ab2 =Cb ·Kb2
如果我們在試驗中測得混合液在波長λ1 和λ2 的吸光度分別為A1 和A2 ，代入上面式子，則得：
A1 =Aa1 Ab1 =Ca ·εa1 Cb ·εb1
A2 =Aa2 Ab2 =Ca ·εa2 Cb ·εb2
經過整理，則得：
公式(6)(7)即為最后的計算公式。如以比吸收系數k代替摩爾吸收系數ε，公式(6)(7)同樣成立。A1 和A2 是可以在試驗中測得的吸光度，ε可從文獻上查到，因而濃度Ca 和Cb 即可計算得到。
今以葉綠素a和b公式的計算舉例如下：
從文獻(4)中查到80%丙酮溶液1000ml中含有葉綠素a或b1g時，比吸收系數k值為：
此時λ1 為663nm，λ2 為645nm，ka1 =82.04，ka2 =16.75，kb1 =9.27，kb2 =45.60，代入公式(6)(7)經簡化后即得到：
Ca =0.0127 A663 —0.00269 A645 (8)
Cb =0.0229 A645 —0.00468 A663 (9)
公式(8)(9)就是著名的Arnon的計算公式（計算得到的實際系數與該式稍有出入，但對結果無多大影響）。
