哺乳動物細胞基因穩定轉染的實驗

哺乳動物細胞

完全培養液

培養箱 離心管

1.  確定所要轉染的細抱系能呈獨立集落生長。對于貼壁細胞，在10 cm 組織培養培養皿中接種約100個細胞，培養10~12天，毎4天換液1次。亞甲藍染色后對成活的細胞集落進行計數。

2.  確定母代細胞的選擇條件：將一培養皿上生長匯片的細胞按不小于1：15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養液中。培養10天。用合適的選擇培養液每4天換液1次， 并檢查活細胞。

3.  確定轉染母代細胞的最有效的方法。可選用磷酸鈣或電穿孔方法。對于磷酸鈣轉染，在加DNA的前1天，將母代細胞按1：15分傳中完全培養液中。

4.  用目的基因轉染母代細胞，含目的基因的質粒與含標記基因的質粒的摩爾比例不小于5：1。用擔體DNA替代含有目的基因的質粒作為對照，分別進行幾次轉染。
 

5.  在無選擇條件下讓細胞倍增2次。將細胞按1：15分傳于選擇培養液中。

6.  在選擇培養液中接種5個以上培養皿，以得到盡可能多的能挑取和擴增成細胞系的細胞集落數，每4天用選擇培養液換液，培養10~12天，將培養皿對著光成一角度觀察其中的細胞克隆，其中的一只培養皿直可進行染色以便于計算細胞集落數。挑取大的、生長良好的細胞集落。

如果用5：1的比例，沒有必要在轉染前將透擇標記基因與目的基因連接起來：如果選擇需要用大量的選擇性質粒，有時無態保證5：1比例，故要將選擇標記基因及所要研究的目的基因構建在同一個質粒中。如果用含有所研究的基因進行轉染沒有形成克隆，而在含有的對照中卻可產生究隆，則所研究的基因能有細胞毒性。