實驗概要
本文介紹了唾液淀粉酶活性觀察的原理及方法步驟等。
實驗原理
酶是指化學本質為蛋白質的生物催化劑。在一定條件下，酶促化學反應進行的能力即稱為酶活性(酶活力)。影響酶活性的因素是多方面的，如溫度、PH及某些化學物質等都會影響酶的催化活性。在一定條件下，能使酶活性達到最高時的溫度即酶的最適溫度，而能使酶活性達到最高時的PH即酶的最適PH。例如，唾液淀粉酶的最適溫度是37℃，而其最適PH是6.8。能增高酶活性的物質稱為酶的激活劑，能降低酶活性卻又不使酶變性的物質叫酶的抑制劑。凡能使蛋白質變性的因素都可以使酶變性而喪失活性。
酶活性通常是通過測定酶促化學反應的底物或產物量的變化來進行觀察的。
本實驗用唾液淀粉酶為材料來觀察酶活性受理化因素影響的情況。唾液中含有唾液淀粉酶。淀粉在該酶的催化作用下會隨著時間的延長而出現不同程度的水解，從而得到各種糊精乃至麥芽糖、少量葡萄糖等水解產物。而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色與紅色，而麥芽糖與葡萄糖遇碘則不呈顏色反應，如圖所示：
主要試劑
1. 0.5%(W/V)淀粉溶液：稱取0.5g可溶性淀粉，加少量預冷的蒸餾水，在研缽中調成糊狀，再徐徐倒入約90ml沸水，同時不斷攪拌，最后加水定容為100ml即成。要求新鮮配制。
2. 稀碘溶液：稱取1.2g I2、2g KI，加少量蒸餾水溶解后，再加蒸餾水至200ml。保存于棕色瓶中，用前5倍稀釋。
3. 不同PH溶液：
A液—0.2mol/L Na2HPO4溶液：稱取35.62g Na2HPO4·12H2O，將之溶于蒸餾水后定容至1000ml。
B—0.1mol/L檸檬酸溶液：稱取19.212g無水檸檬酸，將之溶于蒸餾水后定容至1000ml。
1) PH5.0緩沖液——取A液10.3ml、B液9.7ml混合而成。
2) PH6.8緩沖液——取A液14.55ml、B液5.45ml混合而成。
3) PH8.0緩沖液——取A液19.45ml、B液0.55ml混合而成。
4. 0.5%(w/v)蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，將之溶于蒸餾水后定容至100ml。
5. 斑氏試劑：
A液—稱取無水CuSO417.4g，將之溶于100ml預熱的蒸餾水中，冷卻后用蒸餾水稀釋至150ml。
B液—稱取檸檬酸鈉173g、Na2CO3100g，再加蒸餾水600ml，加熱溶解后冷卻，用蒸餾水稀釋至850ml。
將A液與B液混合即得斑氏試劑。
6. 1%(w/v)NaCl溶液：稱取NaCl 1g，將之溶解后用蒸餾水稀釋至100ml。
7. 1%(w/v)CuSO4溶液：稱取無水CuSO4 1g，將之溶解后用蒸餾水稀釋至100ml。
主要設備
1. 白瓷板(或比色板)
2. 恒溫水浴鍋
3. 電爐
實驗步驟
1．唾液淀粉酶應用液的制備
1) 每人取一個干凈的飲水杯，裝上蒸餾水。
2) 先用蒸餾水漱口，將口腔內的食物殘渣清除干凈。
3) 口含約20ml蒸餾水，做咀嚼動作1~2min，以分泌較多的唾液。然后將口腔中的唾液吐入一個干凈的小燒杯中。
4) 取一塊干凈的白瓷板，按下表操作：
穴號 試劑(滴) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
蒸餾水(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 棄去 |
唾液[注2](滴) | 2→ | 2→ | 2→ | 2→ | 2→ | 2→ | |
0.5%淀粉溶液(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |
碘液[注3](滴) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
觀察結果(顏色)，以呈棕紅色者濃度為準，稀釋原唾液作應用液。
2．溫度對酶活性的影響
1) 取3支試管，按下表進行實驗。
試管編號 | 1 | 2 | 3 |
0.5%淀粉(ml) | 5 | 5 | 5 |
PH6.8緩沖液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
稀釋唾液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
不同溫度(℃) | 置冰水浴中 | 置37℃水浴中 | 置沸水浴中 |
將各管中的試劑加好后混勻，然后及時在上述溫度下分別進行處理。
2) 在干凈的比色板上，于各孔穴中分別滴加2滴碘液。
3) 每隔1min從第2支試管中取反應液1滴，與比色板孔穴中的碘液混合，觀察顏色的變化。
4) 待第2支試管中的反應液與比色板孔穴的碘液混合后顏色不再變化時，取出試管，并將在沸水浴中處理的試管用冷水冷卻，然后向各試管中滴加碘液1~3滴。
搖勻后觀察并記錄各管顏色，比較管中淀粉水解的程度，說明溫度對酶活性的影響。
3．PH對酶活性的影響
1) 取3支試管，按下表編號進行實驗。
管號 | 1 | 2 | 3 | |
0.5%淀粉(ml) | 2 | 2 | 2 | |
不同PH的緩沖液(ml) | PH5.0 PH6.8 PH8.0 | 2 | — | — |
— | 2 | — | ||
— | — | 2 | ||
稀釋唾液(滴) | 10 | 10 | 10 |
搖勻后，將各管置于37℃水浴中處理。
2) 每隔1min從PH6.8的試管中取出1滴反應液滴于白瓷板上，隨后滴加稀碘液1滴，觀察其顏色變化。
3) 待顏色呈棕色時，向各管中加稀釋碘液1~3滴。觀察各管顏色，比較各管中淀粉水解的程度，解釋PH對酶活性的影響。
4．酶反應的特異性
1) 取2支試管，按下表編號后進行實驗。
試管號 | 1 | 2 |
0.5%淀粉(ml) | 2 | — |
0.5%蔗糖(ml) | — | 2 |
稀釋唾液(ml) | 1 | 1 |
2) 搖勻后，將各管置于37℃水浴中處理10min。
3) 取出試管，分別加入斑氏試劑2ml，混勻。
4) 將各管置于沸水浴中煮沸2~5min。觀察并解釋結果。
5．激活劑與抑制劑對酶活性的影響
1) 取3支試管，按下表編號后進行實驗。
管號 | 1 | 2 | 3 |
0.5%淀粉(ml) | 3 | 3 | 3 |
PH6.8緩沖液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
1%NaCl溶液(ml) | — | 1 | — |
1%CuSO4溶液(ml) | — | — | 1 |
蒸餾水(ml) | 1 | — | — |
稀釋唾液(ml) | 1 | 1 | 1 |
2) 將各管搖勻后，一起放入37℃水浴中保溫。
3) 每隔1min從第1支試管中取出1滴反應液滴于白瓷板上，隨后滴加稀碘液1滴于此滴反應液中，觀察其顏色變化。
4) 待加碘后顏色呈棕色時，取出3支試管，分別加入稀碘液1~3滴。觀察、比較各管顏色的深淺，并解釋之。
注意事項
1. 可以根據實際情況，用紗布或濾紙過濾一下收集濾液使用。
2. 加唾液時，只在第1穴中加入2滴新制備的唾液。將之與該穴中的蒸餾水混勻后，取出2滴加入第2穴中。待混勻后又從第2穴中取出2滴加入第3穴。如此繼續操作，直到從第6穴中取出2滴棄去。待穴中顏色呈紅棕色時，即可照該穴中唾液的稀釋度稀釋制備的唾液，并用稀釋好的唾液進行下面的實驗。
3. 在往白磁板的孔穴內依次加完蒸餾水、稀釋好唾液并且加完淀粉溶液之后，加入碘液之前，應放置5min。
4. 為確保實驗的效果，在加入試劑時宜在冰浴條件下進行，尤其是氣溫較高的南方地區要注意。
5. 加唾液時應從第1管開始依次進行，前后管之間大約相隔時間5~7s。
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