嗅球成鞘細胞

L-多聚賴氨酸I型膠原蛋白酶HBSSDMEM FBSDMEM BS單克隆抗體第二抗體Sprague-Dawley大鼠

Leibowitz L-15 培養液70%乙醇

培養瓶培養皿蓋玻片Petri培養皿15ml帶蓋聚丙烯錐形管7號彎鑷和直鑷帶蓋圓底聚苯乙稀管彎解剖剪手術刀切除用的板和針熒光激活細胞分選儀

準備分離的 OEC 懸液

1. 通過斷頭處死大鼠（Sprague-Dawley 大鼠：生后 6~8 d 。盡管能夠從任何年齡大鼠分離 OEC，但是從新生大鼠獲得的 OEC 比年齡大的大鼠多）。用 15~20 只大鼠取細胞，FACS （熒光激活細胞分選儀（FACS；B-D Biosciences）分選這些細胞需 2~3 h，分選得到的 OEC 足以覆蓋 10~15 張蓋玻片，每張蓋玻片 10000 個細胞。

培養瓶、培養皿和蓋玻片：用 13.3 mg/ml L-多聚賴氨酸預涂

(a)孵育 1~24 h；

(b)用 D-PBSA 洗一下；

(c)使用前晾干。

2. 將頭背側部分定于切除板上，用 70 % 乙醇噴灑頭部。

3. 使用前將全部器械用 70 % 乙醇浸泡，然后搖晃器械，使其變干。

4. 用尖彎剪除去皮膚，然后作環形切口，除去顱蓋，在鼻尖處顯露腦和兩個嗅球。



5. 用彎鑷從腦輕輕取下嗅球，放入有一滴 L-15 (含有慶大霉素）的 Petri 培養皿。

6. 用無菌手術刀片將嗅球切成小塊。

7. 將嗅球小塊放入含有 1 ml 膠原蛋白酶儲藏液和 1 ml L-15 的小瓶中。

8. 在 37°C 條件下，孵育嗅球小塊 30~45 min 。

9. 將懸液離心（1000 r/min，5 min），然后吸去上清液。

10. 用 1 ml 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 混懸嗅球組織。

11. 神經膠質細胞易受損傷。因此，須輕輕分散嗅球組織，以形成單細胞懸液, 注意不要產生氣泡。通過 19 G 皮下注射針分散嗅球組織，然后通過 23G 皮下注射針分散。

12. 加入 5 ml 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS，將懸液離心（1000 r/min，10 min )。然后，吸去上清液，用 DMEM-FBS （DMEM （GIBCO），添加 5 % FBS）混懸細胞，細胞濃度為 5×10⁶ 個/ml。

用 FACS 分選 OFC

為了盡吋能從被分選的細胞中除去較多的 O4⁺ 少突膠質細胞，最好用半乳糖腦苷脂的第二抗體（抗鼠 IgM-熒光素和抗小鼠 IgG3-藻紅蛋白（Southern Biotechnology Associates 或 Cambridge Biosciences））（anti-GalC) [ Ranscht et al.，1982；Barnett et al.，1993 ] 標記細胞，以辨別少突膠質細胞和 OEC。在這方面，可進行雙色分選，用兩種抗體標記的不需要的細胞可忽略。用 FACSVamage 分選 1 h 。

13. 分散組織后，將 5×10⁶ 個細胞放入 15 ml 離心管，用 500 μl O4 和 ami-GalC 抗體雜交瘤上清液的混合液混懸細胞，在 4°C 條件下孵育 30~45 min 。細胞總數將超過 5×10⁶ 個，故應準備足夠的離心管。如果雜交瘤上清液不含有高濃度抗體，增加細胞數將導致 O4⁺ 細胞的百分比明顯降低。類似分析也用于 anti-GalC 雜交瘤上清液。因此，使用前常需要通過 FACS 分析滴定抗體。

14. 用 DMEM-FBS 將細胞洗 2 次后，再用 500 μl 含有羊抗小鼠 IgM-熒光素（1：100） 和羊抗小鼠  IgG3-藻紅蛋白（1：100）的 DMEM-FCS 混懸，在 4°C 條件下孵育 30 min。

15. 通過離心，用 15 ml DMEM-FBS 將細胞洗 2 次。然后，用冰冷的 DMEMFBS （DMEM (GIBCO ) ，添加下列成分（Bottenstein 和 Sato，1979)：25 mmol/L （4.5 g/L）葡萄糖、25 μg/ml 慶大霉素（Invitrogen）、0.0286% (V / V ) BSA pathocyte ( MP Biomedicals)、2 mmol/L 谷氨酸胺、10 μg/ml 牛膜島素、100 μg/ml 人轉鐵蛋白、0.2 μmol/L 孕酮、0.10 μmol/L L-腐胺、0.45 μmol/L L-甲狀腺素、0. 224 μmol/L 硒和 0.49 μmol/L 3，3， 5-L-三碘甲狀腺原氨酸。除慶大霉素和 BSA pathocyte 外，其余試劑都是 Sigma 公司生產的）混懸分選管（2085，BD Biosciences）內的細胞，密度為 2×10⁶個/ml。將分選管放在冰上。當細胞放在冰上時，抗體標記細胞的 FACS 圖像至少 3~4 h 內是穩定的。

16. 本操作步驟敘述 FACStar 細胞分選儀分選細胞的方法。然而，任何種類的細胞分選器應產生類似的結果。使激光排列成 488 nm 激發光線。須設定熒光補償，以除去每種熒光源中的過剩熒光。在分選單獨用第二抗體標記的細胞之前，應分析對照細胞，以便于解釋非特異性標記和通過減少光倍增管的增益除去非特異性熒光。

17. 將細胞分選窗設置在 O4⁺ GalC^－ 附近。O4⁺ 嗅球細胞的平均百分比應為 10% ± 1% 。

18. 將 O4⁺ GalC^－ 細胞分選入含有 4 ml DMEM-FBS 的圓底聚苯乙烯筲。

19. 分選后，將分選的細胞移入 15 ml 離心管。用培養液清洗分選管，將清洗液加入離心管，然后加入 DMEM-FBS。離心（100 g，15 min）。

20. 吸去上清液，用 DMEM/BS 混懸細胞。用 DMEM/BS：ACM（1：1）稀釋時，可獲得理想的 OEC 活力和生長 [ Barnett et al. ，1993 ] 。ACM 是用 DMEM/BS 培養 48 h 后從純化的皮質星形膠質細胞單層 [ Noble and Murrey，1984 ] 收集的 。