噬菌體展示技術

1985年，Smith G P第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創建了噬菌體展示技術。該技術的主要特點是將特定分子的基因型和表型統一在同一病毒顆粒內，即在噬菌體表面展示特定蛋白質，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結構基因。另外，這項技術把基因表達產物與親和篩選結合起來，可以利用適當的靶蛋白將目的蛋白或多肽挑選出來。近年來，隨著噬菌體展示技術的日益完善，該技術在眾多基礎和應用研究領域產生的影響已日漸明顯。
1 噬菌體展示技術的原理
噬菌體展示技術是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結合特性的目標噬菌體。
2 噬菌體展示系統
2.1 單鏈絲狀噬菌體展示系統
（1）PⅢ展示系統。絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個～5個拷貝PⅢ蛋白，其在結構上可分為N1、N2和CT 3個功能區域，這3個功能區域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細胞膜有關，而CT構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分，并將整個PⅢ蛋白的C端結構域錨定于噬菌體的一端。PⅢ有2個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質融合于PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，該系統保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即所謂“單價”噬菌體。
（2）PⅧ及其他展示系統。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側，C端與DNA結合，N端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒有2 700個左右PⅧ拷貝[8-9]。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數，此時可融合多肽甚至抗體片段。 此外，尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統的研究報道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點，可以用于研究外源蛋白C端結構區域功能。從所掌握的文獻來看，該系統主要用于cDNA表面展示文庫的構建，并取得了不錯的篩選效果。
2.2 λ噬菌體展示系統
（1）PV展示系統。λ噬菌體的PV蛋白構成了它的尾部管狀部分，該管狀結構由32個盤狀結構組成，每個盤又由6個PV亞基組成。PV有兩個折疊區域，C端的折疊結構域（非功能區）可供外源序列插入或替換。目前，用PV系統已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465 ku）和植物外源凝血素BPA（120 ku）等。λ噬菌體的裝配在細胞內進行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質。該系統展示的外源蛋白質的拷貝數為平均1個分子/噬菌體，這表明外源蛋白質或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。
（2）D蛋白展示系統。D蛋白的分子質量為11 ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結合到λD-噬菌體表面，而體內組裝是將含D融合基因的質粒轉化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補償溶源菌所缺的D蛋白，通過熱誘導而組裝。該系統有一個很好的特點，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質時特別有用。
2.3 T4噬菌體展示系統
T4噬菌體展示系統是20世紀90年代中期建立起來的一種新的展示系統。它的顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細胞內裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質，很少受到限制。成功地將大小約215 aa SOC/m E2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面。令人值得關注的是，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時可優于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實上，在DNA包裝被抑制時，T4是雙股DNA噬菌體中唯一能夠在體內產生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。
3 噬菌體展示技術的局限性
（1）在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統還要經過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數量一般限制在109。
（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗中，由于部分未折疊的蛋白在細菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達差，也是體內選擇壓力的一個例子。真核細胞蛋白在細菌中表達差是因為它們的蛋白質合成與折疊機制不同的緣故[15]。
（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。
（4）由于噬菌體展示系統依賴于細胞內基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。
4 結語 噬菌體展示技術經過近20年的發展和完善，已成為生命科學領域的一項重要技術，廣泛應用于抗原抗體庫的建立、藥物設計、疫苗研究、病原檢測、基因治療、抗原表位研究及細胞信號轉導研究等。噬菌體展示系統模擬了自然免疫系統，使我們有可能模擬體內抗體生成過程，構建高親和力抗體庫。由于噬菌體展示技術實現了基因型和表型的有效轉換，使研究者在基因分子克隆基礎上實現了蛋白質構象體外控制，從而為獲取具有良好生物學活性的表達產物提供了強有力手段。另外，噬菌體展示技術已成為不經過免疫獲取特異性人源抗體的新途徑，為獲取對人類和動物疾病有診斷和治療價值的單克隆抗體提供了重要手段。--