回歸化學的2018Nobel化學獎：酶的定向進化

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諾貝尓獎的創立者Alfred Bernhard Nobel本身是一位化學家。可是諾貝尓獎最喜歡搞跨界的就是化學獎，總喜歡頒給不那么化學的發現。111次的諾貝爾化學獎20+次頒給生物學（畢竟還是有一門交叉學科叫生物化學），20+次頒給物理學，甚至還有1次頒給農學。

2018年的諾貝爾化學獎一半授予美國科學家Frances H. Arnold，表彰她對酶開展的定向進化研究；另一半授予給美國科學家George P. Smith和英國科學家Gregory P. Winter，表彰他們對“噬菌體展示”的發明和應用（圖1）。乍一看，今年又是生物學搶了化學獎的風頭。其實不然，至少“酶的定向進化”某種程度上回歸了化學的初心。

圖1 2018年諾貝爾化學獎得主，引自諾貝爾獎官網

何為“酶的定向進化”？

大自然是這個世界上最偉大的化學家，而它最高階的化學魔法就是生命。生物體從外界環境中攝取食物或者說原材料，在體內轉化為維持自身生命活動需要的各種分子，這一過程中大自然也創造并不斷進化著最神奇的化學反應催化劑——酶。那么，人類能不能改造酶來實現需要的化學反應呢？答案是肯定的。酶的本質是蛋白質，由20種不同的氨基酸組成。以前生物學界有句老話“一個基因一個酶”，基因決定了酶的氨基酸組成，只要修改了編碼酶的基因DNA，就能夠改變酶的氨基酸組成。

傳統的學院派做法往往是：首先研究酶催化化學反應的分子機制，找到它識別結合反應物或者催化反應的關鍵位點，最好再加上高大上的結構解析和計算機分子動力學模擬，然后設計和構建酶關鍵位點的各種突變體，最后用實驗驗證酶的改造效果。這種流程非常符合生物化學的邏輯，但在新科諾獎得主Arnold眼里，效率太低，大概率是要失敗的。

Arnold出生在一個核物理學家家庭，本科讀的是普林斯頓大學機械與航天工程專業，博士在加州大學伯克利分校轉到化工專業，博士后階段又開始做生物化學的工作。這種跨界的背景讓她能用一個全新的視角看待酶的改造工程。

她的選擇看似有些簡單粗暴：管他什么分子機制，把酶每一個氨基酸都突變一下，試試看有什么效果。問題是，就算一個簡單的酶往往也有200-300個氨基酸，如果把每一個位點都變成其他19種氨基酸，算一下19200-19300種排列組合就知道幾乎是不可能的。所以她使用了大自然另一個高階魔法，進化！進化就是大自然設定了一個環境的標準，在物種的多樣性中選擇出更適宜環境的生命，淘汰那些不適宜環境的生命。Arnold的工作就是在實驗室里對酶開展人工進化，簡單來說有如下步驟（圖2）：

圖2 酶的定向進化的流程示意圖 引自諾貝爾獎官網

1.在酶的DNA編碼中隨機引入突變；

2.把這些突變的DNA編碼插入細菌里，讓細菌生產帶有不同突變的酶；

3.人為設定一個篩選標準，保留滿足設定標準的酶突變體，而淘汰不滿足標準的酶突變體；

4.對保留下來的酶突變體再進行下一輪的隨機突變，如此反復循環只到找到最適應篩選標準的酶突變體。

Arnold用這種人工進化策略改造的第一個酶是枯草桿菌蛋白酶。這種酶能夠切割降解其他蛋白質，但它只在水溶液中發揮功能，在有機試劑中活力極低。經過三輪上述“隨機突變-篩選”的循環，Arnold在1993年找到一個突變體，在化工產業常用的有機溶劑（二甲基甲酰胺DMF）里的活力比它初始的模版提升了256倍。這個突變體包含了10多個位點的突變，其中很多并不是酶的催化活性位點或者底物結合“口袋”，用傳統的學院派策略恐怕是很難找到這種排列組合的。這是酶定向進化第一次展示它的力量。

隨后Arnold實驗室地把這一方法成功拓展到更多的酶和化學反應上，使這些酶能耐受更嚴苛的反應條件，識別全新的底物分子，催化全新的化學反應。另一方面，酶定向進化的方法學不斷改進，也有了長足的發展。不論是隨機突變的引入，初始模版的選擇，還是新選擇標準和篩選策略的設立，Arnold實驗室始終走在前列，引領著研究的方向。此外，2013年過世的荷蘭科學家Willem P. C. Stemmer建立的DNA體外同源重組技術（DNA shuffling）對定向進化的效率提高也有重大貢獻。

酶的雜泛性與定向進化

Arnold描述她的工作是在復制大自然的設計（copy nature's design process），與我們中國人講藝術要“法自然，師造化” 有異曲同工之妙。

傳統的思維里，酶的底物和催化反應被認為具有嚴格的特異性。然而近年來研究發現很多酶能催化不同于其天然的底物和化學反應的雜泛性。這種雜泛性是天然的客觀存在，然而生物體在此時此刻可能并不需要酶的這種功能。隨著環境變化給生物體帶來新的生存壓力，這種原本不需要的功能變成了生存的需要。突變可能會放大這種雜泛性，從而使得生物體在自然選擇中獲得優勢。這就是進化，大自然最強大的力量。酶的天然進化使生物體擁有更特異更高效的催化劑，催化全新的化學反應來應對環境的壓力和選擇。

Arnold實驗室的策略是發現酶分子新的雜泛性，并用定向進化加以放大，就是模仿大自然這種天然存在的力量，只是這一次的“進化”不再依賴盲目的自然選擇，而是由人類的理性思考和意愿定向引導。

“酶的定向進化”有哪些應用？

酶的定向進化能夠帶來自然界原本不存在的全新化學反應。

細胞色素P450本身就是一類多功能的酶，圖3左側藍色部分列出了能催化的天然化學反應。Arnold實驗室運用酶的定向進化策略改變細胞色素P450的氨基酸組成，使其能夠催化圖3右側粉色部分非天然的全新化學反應。

圖3細胞色素P450催化的天然反應（藍色）及其定向進化產生突變體催化的非天然反應（粉色）

引自Arnold FH (2015) The nature of chemical innovation: new enzymes by evolution. QRB 48:404-410.

酶的定向進化甚至能夠帶來自然界原本不存在的化學鍵。

盡管有硅基生命的猜想，人們至今還沒有在自然界中發現過碳和硅兩種元素間的共價連接。此前只有化學家通過人工合成獲得碳-硅鍵連接。2017年Arnold實驗室使用定向進化改造海洋紅嗜熱鹽菌里的細胞色素C酶，使其成功將硅和碳鍵連起來，而且把此前人工合成的反應效率提高了15倍。

酶的定向進化給化工產業也帶來革命性的變化。

定向進化改善了酶對有機溶劑的抗性、熱穩定性、對非天然底物的親和力等性質，從而使其能滿足工業生產的需要。前面提到經過定向進化改造能在化工溶劑DMF中工作的枯草桿菌蛋白酶就是這樣的例子。今天，定向進化開發的酶已經廣泛用于生物燃料，化學品材料和藥物的工業生產。另一方面，使用定向進化開發的酶用較溫和的生物技術取代了苛刻的工業過程，不再需要有毒的重金屬或大量有機溶劑，提供了一種清潔綠色的全新工業模式。

“酶的定向進化”的化學屬性

以前一些讓人覺得“很生物”的諾貝爾化學獎往往是揭示特定生命活動的化學反應本質，本質上還是一個生物學的問題。

不可否認，“酶的定向進化”是一項生物技術，但它的核心卻是利用生物技術去設計和實現全新的化學反應，解決化學合成和化工產業的問題，所以具有更多的化學屬性。當被問到“如何用簡單通俗的語言總結獲獎發現的意義”時，主持化學獎頒獎發布會的瑞典皇家科學院秘書長Gran K. Hansson總結說，酶的定向進化是一種“更安全、更綠色的化學”。雖然“酶的定向進化”穿著生物技術的外衣，卻不妨把它看作是諾貝爾化學獎跨界后的一種回歸。

其實，“跨界”、“回歸”都只是玩笑話，科學沒有那么多的門戶之見。諾貝爾的遺愿和諾貝爾獎設立的初衷是為了獎勵那些“為人類做出最大貢獻”的人，而建立的“酶的定向進化”Arnold無疑是其中的杰出代表。當被諾貝爾獎官網記者問到研究生涯最有趣的發現是什么時，她回答說：“最有趣的永遠是我正在進行的研究”，而目前她最感興趣的是如何進化創新本身。讓我們拭目以待!

參考文獻

Chen K, Arnold FH (1993) Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:5618-5622.

Stemmer WP (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 91:10747-10751.

Arnold FH (2015) The nature of chemical innovation: new enzymes by evolution. QRB 48:404-410.

Kan SB, Lewis RD, Chen K, Arnold FH (2016) Directed evolution of cytochrome c for carbon-silicon bond formation: Bringing silicon to life. Science 354:1048-1051.

Arnold FH (2018) Directed evolution: bringing new chemistry to life. Angew. Chem. Int. Ed. 57:4143-4148.