圖像分析在植物染色體和染色質結構研究中的應用

　　染色體核型分析對遺傳進化和多樣化的研究有重要作用，詳細的染色體圖譜被認為有助于植物育種，并幫助生物學家進行基本的生物學和遺傳學研究。圖像分析在染色體核型研究中應用廣泛，然而通過計算機技術對染色質結構圖像進行客觀分析存在諸多困難。近日，來自日本神戶大學的Nobuko Ohmido團隊系統地介紹了測量和評估植物染色體和染色質結構的一系列計算方法。相關論文“Applications of image analysis in plant chromosome and chromatin structure study” （點擊文末“閱讀原文”下載PDF全文）發表在Quantitative Biology期刊上。

　　全文概要

　　植物基因組研究中廣泛的可視化程序的應用對于獲得基因組及其進化的定量數據至關重要，為了開發染色體圖譜，一種既能進行客觀分析又能避免人類主觀判斷和模糊表達的圖像分析方法是非常有效的。在本綜述中，作者評估了圖像分析技術的數字化效果；染色體和染色質的定量分析包括連接染色質構象的正確位置信息。另外，作者還描述了使用先進的氦離子顯微鏡對小染色體FISH圖譜和核型、細胞核結構、纖維DNA和納米級染色質結構的圖像分析系統。最后，作者討論了為植物染色體和染色質結構開發的一個有效圖像分析應用程序。

　　植物小染色體的核型成像

　　作者首先介紹了在小染色體的植物中應用聚合（CP）模式和CHIAS系列方法構建定量染色體圖譜的研究。植物（如禾本科和豆科）的小染色體在傳統的帶型分析方法（如N和C帶狀方法）中不顯示清晰的條帶。這是因為在有絲分裂期，微小且大小相似的染色體阻礙了對單個染色體的識別，染色體的形態學特征難以分析。

　　一種特征性的聚合模式（CP）已應用于水稻有絲分裂過程中染色體的觀察。CP是染色質凝結區和非凝結區的區分。使用CP的特征作為圖像分析的參數，可以識別染色體并構建定量的染色體圖譜。蓮花（Lotus japonicus）和紅三葉草（Trifolium pratense L.）的染色體圖也已經用CHIAS III制備。CHIAS仍在不斷進行升級，目前最新版本是CHIAS IV。

　　通過CHIAS對染色體密度進行量化，對重復序列進行原位定位，通過FISH對基因和/或標記進行高分辨率測繪，有望促進對基因密度、片段復制和其他染色體重排的分析，并產生植物整合的染色體圖譜。

　　基因組大小在植物和動物的進化中起著重要作用，因為基因組大小的變化可能伴隨著對環境條件的進化適應。流式細胞儀被廣泛用于利用熒光強度確定植物基因組大小，且間期細胞的圖像分析對于了解染色質凝結的特征和細胞核的結構非常重要。

　　作者介紹了基因組大小和間期核型之間的關系：在大于4×104Mb基因組的2C值中，染色體以弦狀方式穿過細胞核，在整個細胞周期中顯示有Rabl取向。而在一些基因組小于1×10,000 Mb（2C值）的植物物種，如擬南芥和水稻，染色體在其間期細胞核中以擴散的形式存在，沒有Rabl排列。盡管如此，植物中的DNA體積與核體積之比存在一個上限。事實上，DNA體積和核體積之間的恒定比率不應超過3%。

　　處于間期的細胞可以通過明顯的形態特征和某些染色體區域的分布模式來描述，如染色質核仁（CCs）。處于間期的細胞在其異染色體CCs中表現出不同的分布模式，這可以作為植物中每個品系、物種或屬的細胞學特征指標。然而，通過在顯微鏡下檢查細胞核，很難客觀地確定靜止染色體的類型大小。獲得核內核仁的可重復性和定量數據是客觀分型最困難的部分。

　　靜止染色體類型的圖像數據可分為四個參數：CC的數量，CC的面積，CC在核內總面積的百分比，以及CC的分布。使用傳統的醋酸地衣紅染色方法，蘭科植物的間期核顯示出許多不同大小的CCs。以前的報道中應用了一種自適應閾值法，該方法經過非銳化掩膜過濾的修改。此外，該方法可用于分析CCs在相間核中的分布模式。CCs的數值參數可以為植物多樣性的系統發育研究提供有用的遺傳信息。

　　作者在有絲分裂和減數分裂前期曾觀察到親代著絲粒行為。為了確定親代細胞核中兩種著絲粒信號集之間的分離，需要使用3D成像技術。這種技術可以測量并計算觀察到的細胞核和數字模擬細胞核中一種物種的著絲粒與另一種物種著絲粒之間的平均最近距離。

　　為了將核結構和功能聯系起來，需要使用成像工具來量化核形態以及染色質區域在3D中的定位和組織。NucleusJ插件可以進行間期細胞核的3D圖像分析，它是Java語言的ImageJ插件，作為ImageJ平臺的jar文件發布。該插件使用來自單個圖像或大型數據集的3D定量測量技術，可鑒定核的形狀、大小、核內物質及其在核內的位置。NucleusJ對于有興趣量化核、核物質或染色質區域的大小、形狀以及后者在核空間中的定位的用戶是很有幫助的。NucleusJ也可用于分割FISH信號。升級版的NucleusJ 2.0還可用于表征當植物突變體中核形態和染色質結構發生強烈改變時，用DNA染料染色或用3D-DNA FISH標記的細胞核。

　　間期細胞核內的環境表觀遺傳學成像

　　染色質核仁（CCs）在細胞核內呈分散狀態，并且異染色質僅局限在染色體的著絲粒周圍和核仁區域。這種明顯的特點使得研究間期核內單個染色質結構域的空間排列和功能特性成為可能。表觀遺傳標記，如DNA甲基化、組蛋白甲基化和乙酰化，在植物細胞生長和發育中發揮著重要作用。分化細胞表現出相對復雜的組蛋白修飾模式，而干細胞表現出較少和更簡單的修飾。熒光蛋白通常用于顯示特定的核蛋白，免疫染色也可用于可視化特定分子的修飾，如甲基化胞嘧啶和特定核蛋白的發育過程、光反應和非生物應激反應。染色質可塑性被認為與植物對環境變化的適應有關。

　　特定的表觀遺傳學變化與植物的生長和發育有關。組蛋白H4乙酰化（H4K5ac）、組蛋白H3甲基化（H3K4me2和H3K9me2）和5mC在大麥分生組織中具有獨特而特殊的模式。異染色質標記物H3K9me2在分化細胞、邊界分生-延伸區和表皮細胞中有較高的濃度；然而，5mC在根冠和遠端分生組織中占優勢。在近端分生組織區域，兩種異染色質標記都不豐富。然而，大多數異染色質標志物（H3K5ac和H3K4me2）高度集中在經歷高度活躍的細胞分裂的分生組織周圍區域。

　　DNA纖維拉伸的成像

　　染色質纖維的基本單位是核糖體，它由大約147bp的DNA單位盤繞在八聚體組蛋白分子（H2A、H2B、H3和H4的兩個亞單位）的核心上，與連接體組蛋白H1相關。核糖體單元與其他單元連接，形成10納米的纖維，被稱為 "串珠"。植物中高度濃縮的體細胞中期和粗線期染色體的FISH分辨率估計分別為4–5Mb和1.2Mb，因此，兩個相距小于1Mb的DNA序列不能可靠地解析。為了增加光鏡分辨率的光學限制（大約小于100納米），例如結構化照明顯微鏡（SIM）、光激活定位顯微鏡（PALM）、隨機光學重建顯微鏡（STORM）和刺激發射耗損顯微鏡（STED）提供了對DNA和蛋白質的分子結構、相互作用和功能的新見解。

　　除了超分辨率顯微鏡，還可以從體細胞中提取延伸的染色質纖維（EDFs）。纖維-熒光顯微鏡可用于實現最高分辨率的相鄰DNA序列的映射，其距離僅為1kb。Fiber-FISH被成功地用于對擬南芥、水稻、番茄和甜菜的染色體域進行詳細研究。多色纖維-熒光顯微鏡可用于測量植物染色體重復區的DNA序列之間的物理距離，這些序列在基因組測序項目中無法被組裝。EDF和細胞核中的DNA或蛋白質的信息可以通過視覺觀察，也可以用圖像分析方法進行定量分析。

　　CHIAS-Straight可以用來對EDF的纖維信號進行定量分析（圖1）。CHIAS-Straight是一個免費的應用程序，用于測量纖維-FISH和免疫染色纖維的成像性能。該軟件由Ohmido實驗室開發，可以在實驗室網站進行下載和安裝。

　　Fiber-FISH方法還可用于研究mtDNA插入物。在真核生物中，mtDNA自然轉移到細胞核中會產生核mtDNA拷貝，人類體細胞就含有成千上萬的mtDNA拷貝。這些mtDNA插入物來自復雜的復制和丟失事件，無法用傳統的方法，如PCR或southern blot雜交來表征。因此，Koo和他的同事開發了纖維熒光顯微鏡成像，進行mtDNA重復計算，以分析整個人類基因組中核mtDNA的插入。這種方法被稱為mtDNA FIBER-FISH，并被用于癌癥細胞系和原發性腫瘤以及推進基礎和轉化性癌癥研究。

　　植物染色體的納米結構成像

　　染色質纖維的壓實導致核小體的形成，核小體由一個DNA單元盤繞著與連接體組蛋白分子相關的核心組成。更高水平的染色質纖維以淺層超卷的30納米結構出現，被稱為螺線管。氦離子顯微鏡（HIM）或掃描氦離子顯微鏡是一種最先進的納米制造成像技術，它利用了氦離子在樣品表面相互作用的正電荷。由于有足夠的二次電子（SE）和低光束損傷，這項技術不需要金屬涂層，因此HIM是一個強大的工具，用于納米級的成像以及生物軟樣本表面的分析。然而，HIM還沒有被用來研究植物染色體的結構。

　　染色體可以用高分辨率的掃描離子顯微鏡和基于掃描氦離子束的HIM成像技術來觀察。以大麥染色體的觀察為例，作者將分析過程分為若干個步驟（圖2）。使用HIM圖像定義染色質纖維的區域（步驟1至3）（圖2-C）。然后在染色質區域畫出中線（步驟4和5）（圖2）。在步驟6至8中，染色質纖維的寬度線被畫在與中線垂直的位置（圖2）。最后，測量染色質區域的寬度線的大小（步驟9）。寬度線根據其長度用各種顏色表示（圖2）。

　　據報道，凝聚的染色質的完整性取決于陽離子的結合。為此，CHIAS被用來定量測定因陽離子耗盡而彎曲的染色體被拉直后Ca2+和Mg2+耗盡的效果。使用CHIAS IV成功地拉直了彎曲的染色體。這種拉直也可以提供有關染色體的定量數據。

　　光學成像分析在新植物基因組研究中的應用

　　最后，作者介紹了一系列利用成像方法進行基因組測繪的研究和應用場景。通過光纖-FISH成像分析，利用植物基因組的光學測繪技術進行下一代基因組測繪，使基因組組裝達到 "接近完成 "的水平，以進行可靠和詳細的基因注釋和結構變化評估。光學繪圖也可以應用于動態染色體結構變異（SV），如倒位、缺失、易位和復制。光學圖譜還應用于大規模支架的下一代序列所調查的基因組組裝，包括通過結合基因組圖譜數據對contig方向和空白區域的準確長度信息，然后對錯誤的組裝數據進行修正。

　　最近的一個重要發展是基于合成寡聚物的FISH探針的應用。基于寡聚物的探針可以從重復的DNA元素或從單拷貝的DNA序列中設計出來，這是對傳統的使用克隆DNA序列的FISH探針的范式轉變。對特定染色體區域或整個染色體特異性的合成寡頭可以通過計算確定，平行合成，并進行熒光標記。從一個物種的保守DNA序列設計的寡聚物探針可以在遺傳相關的物種中使用，允許比較細胞遺傳學繪圖。合成寡聚物探針的進展將大大擴展FISH在許多植物和農作物物種中的應用。

　　另外，RNA引導的核酸內切酶原位標記（RGEN-ISL）被報道為替代FISH的可視化方法。RGEN-ISL是一種使用CRISPR/Cas9系統對重復性DNA序列進行可視化的簡單方法。它用途廣泛，使用簡單，已被用于可視化細胞核或染色體中的DNA序列，而沒有破壞細胞學樣本結構的變性過程。