土壤微生物的分離與純化

實驗概要

本實驗介紹了土壤微生物分離與純化的實驗原理和方法。了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，掌握顯微鏡下直接計數的技能。

實驗原理

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法。顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫·  霍澤（Petrof  Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。
血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數區（圖），計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。


左上：頂面觀；右上：側面觀；左下：放大后的網格；右下：放大后的計數室
計數區邊長為1mm，則計數區的面積為l mm²，每個小方格的面積為1/400mm²。蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm³，每個小方格的體積為1 /4000mm³。

使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。
已知：1mm³體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm³
所以：1mm³體積應含有小方格數為1000mm³/1/4000mm3=4×10⁶個小方格，即系數K=4×10⁶。
因此：每ml菌懸液中含有細胞數= 每個小格中細胞平均數（N）×系數（K）×菌液稀釋倍數（d）

主要設備

1. 顯微鏡

2. 血球計數板

3. 蓋玻片（22mm×22mm）

4. 吸水紙

5. 計數器

6. 滴管

7. 擦鏡紙

實驗材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養液

實驗步驟

1. 視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋到10-2），以每小格的菌數可數為度。
2. 取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。
3.   將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產生氣泡）。
4. 靜置片刻，將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。
5.   計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央l個大方格的菌數（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。
6. 對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數2—3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數量。
7. 測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內保存。

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