在質粒載體中進行定向克隆實驗

T4 噬菌體 DNA 連接酶 限制性內切核酸酶

ATP 乙醇 苯酚 氯仿 乙酸鈉 TE

瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 旋轉柱層析裝置

一、材料

1. 緩沖液和溶液

ATP (10 mmol/L)，乙醇，苯酚：氯仿（1:1, V/V)，乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。

2. 酶與緩沖液

T4 噬菌體 DNA 連接酶，限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠。

4. 核酸和單核苷酸

載體 DNA ( 質粒），外源或目的 DNA 片段。

5. 專用設備

旋轉柱層析裝置，溫度可調 16℃ 的水浴裝置。

二、方法

1. 用兩種適當的限制性內切核酸酶消化載體（10 ug ) 和外源 DNA 片段。

為進行直接克隆，用兩種限制性內切核酸酶消化閉合環狀的質粒載體，這樣可以識別不同的序列以及產生不同的末端。無論哪段序列，我們應盡可能避免選用在多克隆位點上相距 12 個堿基以內的酶切位點，如果有一個酶切位點被切開，那么第二個酶切位點將離線狀 DNA 分子的末端很近而影響第二個限制酶的酶切效率。在 New England Biolaba 公司的產品目錄中列出了各種限制酶在線狀 DNA 分子末端位點的酶切效率。

閱讀生產廠家的說明以確定兩種限制酶是否可在同樣的緩沖液中工作。如果可以，就能用兩種限制酶同時對質粒 DNA 進行消化。如果兩種限制酶用不同的緩沖液，最好讓消化反應分開進行。此時. 應首先使用適于低鹽濃度的酶。在第一個酶的反應完成后，取少量消化產物通過電泳來確定是否所有的質粒 DNA 已從環狀變為線狀分子，然后適當調整緩沖液的鹽濃度，再加入第二個酶。

2. 苯酚：氯仿抽提及乙醇沉淀法純化被消化的外源 DNA 片段。

根據實驗情況，我們可以參照瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術從外源 DNA 消化產物中分離出目的片段。當外源 DNA 片段制備物中含有能與代替連接的多個限制酶酶切片段時，一般需要做這種純化。許多研究者在連接反應前，常利用瓊脂糖凝膠電泳技術來提高外源目的 DNA 序列的純度，而不是大量篩選轉化子以獲取所需的克隆。

3. 離心柱層析加常規乙醇沉淀純化載體 DNA

這一純化步驟可以從質粒制備物中除去那些由多克隆位點中兩個靠近的限制酶位點經限制酶消化后所產生的小片段 DNA。

4. 用 TE ( pH 8.0) 重新溶解純化出的兩份 DNA 沉淀，使終濃度約為 100 ng/ml。假設 1 bp 相當于 660 Da, 計算 DNA 的濃度（pmol/ml )。

瓊脂糖凝膠電泳檢査兩份 DNA 樣品的大概濃度。

5. 按下列表格將適量的 DNA 轉移至 0.5 ml 的無菌微量離心管中：



(1) A、B 和 C 管中加入：10x 連接緩沖液 1.0 ul，T4 連接酶 0.1 Weiss 單位，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 補至 10 ul。

(2) D 和 E 管中加入：10X 連接緩沖液 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 補至 10 ul，無 DNA 連接酶。

在制備 DNA 片段的過程中，可以將 DNA 片段與水一起加入管中于 45℃ 溫育 5 min，以消除重新復性而導致的末端相互聚合。在連接反應試劑加入之前，可將 DNA 溶液于 0℃ 預冷。為獲得最大效率的連接，反應體系越小越好，一般為 5~10 ul。在反應混合物中，ATP 如作為 10X連接緩沖液的組分，可給載體和外源 DNA 插入片段的體積提供了更大的空間。有些廠家的連接緩沖液中包含有 ATP，這樣在應用時就不必另加 ATP 了。

6. 連接反應混合物置于 16℃ 過夜或 20℃ 4 h。

7. 用稀釋的連接產物轉化感受態大腸桿菌。轉化時，應包括用標準方法制備的已知量的超螺旋質粒 DNA 作為對照，以檢査轉化效率。