摘要：
CRISPR/Cas9基因組編輯技術和新一代測序技術（也稱高通量測序技術），是當今對生命科學研究有重大影響的兩項技術。二者并非毫不相干。有效地將二者聯用，有時可以大大加速科研進程。兩者之間有什么樣的聯系呢？在哪些研究領域或方向上可以聯用呢？上海伯豪生物根據在這兩個領域的技術服務經驗，對相關內容進行了系統地整理。
一．引言
在分子生物學的發展歷史中，人們曾經不止一次地從微生物的某些生命活動中得到啟示，發展出了對于DNA操作有重要意義的工具，如分子克隆用的限制性內切酶和PCR用的耐熱聚合酶。它們為分子生物學的發展帶來了革命性的影響。近兩三年來，另一種從細菌的獲得性免疫系統發展而來的革命性的基因操作工具CRISPR/Cas9受到廣泛關注，其應用和影響范圍仍在不斷擴大。CRISPR/Cas9系統的發現與DNA測序技術分不開，它的發展與推廣仍然得益于DNA測序技術。CRISPR/Cas9技術與近五、六年來同樣快速發展的DNA新一代測序技術（Next
Generation Sequencing, NGS,
也稱高通量測序技術）相結合，不但可以使研究者高效快速地得到一些實驗結果，也拓寬了這一技術的應用范圍。
二．CRISPR/Cas9系統簡介
CRISPR/Cas9技術的產生與DNA測序技術的進步密不可分。1987年在對大腸桿菌E.coli K12的一個區段的測序結果的分析中，研究者首次發現細菌了堿性磷酸酶基因附近存在著成簇的規律間隔的短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR）。在接下來的十多年間，隨著DNA測序技術的飛速發展，微生物基因組測序數據顯著增多，更多的CRISPR在細菌和古細菌中被發現。據估計40%的細菌和90%的古細菌基因組具有CRISPR結構。CRISPR 由一系列短的高度保守的正向重復序列(repeats) 與長度相似的間隔序列（spacers）間隔排列組成（見圖1）。本世紀初，CRISPR位點附近的、高度保守的Cas基因（CRISPR-associated genes）引起了研究者關注。Cas基因是一類基因家族，編碼的蛋白具有與核酸結合功和核酸酶、聚合酶、解旋酶等活性。2005年，得益于病毒、質粒測序數據的日益豐富，通過對測序數據的系統分析，研究者推測間隔序列可能與外來的病毒、質粒有關。通過一系列的研究，人們認識到Cas基因可以與CRISPR序列協同作用，使細菌對病毒具有獲得性免疫功能，而間隔序列則編碼引導Cas蛋白定位的向導RNA的部分區段。
圖1. 基因組CRISPR位點。摘自Doudna JA,
Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering
with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346 (6213) :1258096.
根據Cas基因的不同，人們將CRISPR/Cas系統分為I-III三類。其中II類CRISPR/Cas系統包含一個Cas9蛋白。這類系統最先在改造后用于小鼠和人類基因組編輯，同時也是目前研究最為充分的系統。它只需要單獨的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引導下完成對DNA的定點切割。Cas9蛋白可以通過突變改造為具有不同功能的衍生蛋白，例如只具有DNA結合功能而無切割功能的dCas9和只具有單鏈切割功能的Cas9n（也稱nCas9） 等。Cas9蛋白行使功能需CRISPR轉錄而來的crRNA與反式激活的、與CRISPR 重復區互補的tracrRNA （trans-activating crRNA，tracrRNA） 形成的復合物參與。為了操作簡便，研究者將crRNA和tracrRNA 融合進同一條單鏈中，設計出單鏈引導RNA（single guide RNA，sgRNA）。對靶序列有效的切割還需靶序列相鄰的原型間隔序列毗鄰基序，即PAM （protospacer-associated motif）。圖2顯示了CRISPR/Cas9 系統的主要元件。為了增強系統的特異性或實現某些特定的功能，除了前面提到的對Cas9蛋白的改造外，一些實驗室還對有的元件進行了其它方面的改進。
圖2. RNA
引導Cas9與目標DNA結合并將其切割。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new
frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov
28;346(6213) :1258096.
三．CRISPR/Cas9技術的應用領域
對生物體包括人類自身的基因組進行高效自由地操作是許多生命科學和醫學工作者的夢想。與傳統的基因打靶、ZFN和TALEN等基因組操作技術相比，CRISPR/Cas9技術簡單、高效，也不失精準。它已經成為基因組工程的有力工具。它在生命科學基礎研究、生物技術和醫藥領域有廣泛的應用前景。短短一兩年，該技術成功應用于動植物及微生物的報道已屢見不鮮。在生物學基礎研究領域，它有助于快速解析基因功能及基因間的相互作用；在生物技術領域，它有助于定向育種，有助于抗逆、高產或有特殊經濟性狀的作物或菌種的培育；在醫藥領域，利用它可以快速建立疾病模型，可以進行基因治療和新藥開發。CRISPR/Cas9的推廣和應用步伐可謂一日千里。