在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關系見表Ⅵ-4。
一般培養基用1.05kg /cm2，121.3℃15―30分鐘可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養基用0.56kg/cm2（8磅/英寸2），112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內的培養基以1.05kg/cm2，121.3℃滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶內的培養基最好以1.05kg/cm2滅菌30分鐘。
蒸汽壓力所用單位為kg/cm2（千克/厘米2），它與lb/in2（磅/英寸2）和溫度的換算關系見表Ⅵ-5。
實驗室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種，其構造如圖Ⅵ-4。本實驗介紹手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。
三、器材
牛肉膏蛋白胨培養基，培養皿（6套一包），手提式高壓蒸汽菌鍋等。
四、操作步驟
1.首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。
2.放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
3.加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。
4.用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用 1.05kg/cm2，121.3℃，20分鐘滅菌。
5.滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。
6.將取出的滅菌培養基放入 37℃溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。