實驗方法原理 培養細胞有來源易得、細胞分裂率高和制出標本清晰度高等優點,是制備染色體極好的對象。
實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 HanksNaHCO3培養基血清秋水仙素
儀器、耗材 酒精燈鑷子培養瓶吸管離心管
實驗步驟
1. 培養細胞
取處于指數生長期、用較大瓶皿培養的、80 %~90 %匯合單層培養細胞;
2. 加秋水仙素
使用最終濃度為0.02~0.8 μg/ml營養液;溫箱繼續培養6~10 小時;
或用低溫封閉法:把培養細胞置于4 ℃條件下6~12 小時后,再于37 ℃溫箱中繼續培養6~10 小時處理(加秋水仙素);
3. 采集分裂細胞
可利用分裂中期細胞體變圓與底物附著不牢特點,此時手持培養瓶,左右反復橫向水平搖動,令培養液在培養細胞表面反復沖涮;應用此法可使90 %的中期分裂細胞從瓶壁脫落;注意勿用力過猛,以防多量非分裂細胞脫落影響觀察;
4. 離心
收集培養液,1000 轉/分鐘,離心5~10 分鐘;
5. 低滲處理
吸除上清液、加入預溫至37 ℃的0.075 M KCl溶液,在溫箱中靜置20~30 分鐘;
6. 預固定
向懸液中加新鮮1:3醋酸、甲醇固定液1 ml,用吸管吹打調勻;此措施能起到先使細胞表面輕微固定,可防止固定后細胞粘連成塊;
7. 固定
離心,同4,吸除上清液,加新鮮固定劑5~10 ml;加固定劑時要用一手微斜持離心管,另手用吸管吸取固定劑,把固定劑逐滴滴在離心管壁上,使之慢慢流入離心管中,然后輕輕吹打均勻,置15~20 分鐘;
8. 重復7,末次離心后,小心吸除大部上清,據懸液中細胞密度大小,余下固定液0.5~1 ml;
9. 制片
用滴片法制片,按如下步驟:徹底洗凈載物片,勿留任何油脂,置冰箱中儲存備用。滴片前現從冰箱中取出冷載物片1 張,在載物片表面出現細微水氣時,立即向片的一側滴2~3 滴細胞懸液(如固定液不散,可能因載物片未洗凈或不冷所致),滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥,或用吹風機熱風吹干亦可。如此制備好的標本可置盒中備用(做顯帶或熒光觀察等)或立即進行染色觀察;
10. 染色和封片
一般常用Giemsa染色;取干液Giemsa1 份加pH6.8磷酸緩沖液9 份混合,染色10 分鐘后,水洗、晾干、可直接觀察(適用油浸鏡);如標本需要保存或做長時間觀察,可過二甲苯兩次后,用中性樹膠封片(或先迅速過丙酮兩次,每次30 秒)后,再過二甲苯,然后封片亦可。
其他
一、討論
1. 染色體制備過程是既易又難的方法;易在要求條件簡單、操作不復雜繁鎖,易于獲得結果。
2. 難在制備出的標本不總是非常理想和一致,常出現分裂相數少、染色體分散不良、或染色體過短等,為此在初做時,應試做預試驗,摸清諸條件,能提高成功率。